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小分子PROTAC研究最新进展

发布时间:2020-05-19 07:53:32 | 来源:【药物研发团队 2020-05-19】
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PROTAC由靶蛋白配体、E3泛素连接酶配体和连接链三部分组成。它们可以通过靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体分别识别靶蛋白和E3泛素连接酶,导致靶蛋白多聚泛素化,从而使靶蛋白被蛋白酶体识别并降解。

近年来,PROTAC技术快速发展,在E3泛素连接酶配体、分子设计、光控蛋白降解技术、作用靶点等方面取得了一系列成果,为PROTAC的临床应用奠定了坚实的基础。以下是对近年来PROTAC技术研究成果以及国内外相关技术领域的现状和发展趋势的综述,供开展小分子PROTAC药物研发参考。

一、小分子E3泛素连接酶配体研究进展[1]

早期的PROTAC主要是基于E3泛素连接酶的多肽配体进行设计,但由于多肽具有代谢稳定性差和难以穿过细胞膜等缺陷,使相关技术的应用受到极大的限制。而采用小分子E3泛素连接酶配体的PROTAC能快速扩散到细胞中,与靶蛋白的亲和性更高,代谢稳定性更强,而且有可能采用催化剂量就能使超化学计量的靶蛋白降解。尽管已发现的E3泛素连接酶有600余种,但在PROTAC的设计中只有少数几种得以应用,以下介绍采用不同E3泛素连接酶设计的PROTAC。

用小分子MDM2抑制剂作为E3泛素连接酶配体

MDM2是肿瘤抑制蛋白p53的内在抑制剂,可以使p53多聚泛素化并被蛋白酶体降解。Nutlin-3是MDM2的一种小分子抑制剂,研究者基于这个化合物设计并合成了一个小分子PROTAC-I。这个PROTAC是通过聚乙二醇链将Mutlin-3和非甾体雄激素受体(AR)的配体进行连接,在HeLa细胞中10μM的PROTAC-1可以降解AR,证实了用这种PROTAC降解靶蛋白的可行性。

(二)用小分子clAPl抑制剂作为E3泛素连接酶配体

cIAPl是一种细胞凋亡抑制剂,具有E3泛素连接酶的功能。研究人员通过将小分子cIAPl抑制剂贝他定用连接链与不同的靶蛋白配体连接设计了多种小分子降解剂,这些化合物可将cIAPl募集至靶蛋白,实现在微摩尔浓度下降解核受体的作用,如雌激素受体等。但贝他定可造成脱靶效应,只有高浓度的降解剂才能有效降解蛋白,并且IAP配体可以诱导IAP自身泛素化降解,因此这种新型小分子PROTAC有其局限性。

基于CRBN设计的PROTAC

Cul4-Rbxl-DDB1-cereblon复合物是PROTAC设计中应用最广泛的E3泛素连接酶之一。研究人员发现cerebion可以与免疫调节药物沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺等结合,这些免疫调节药物被广泛应用于PROTAC的设计中。

VHL作为E3泛素连接酶

肿瘤抑制蛋白VHL是一种被广泛应用于PROTAC设计中的E3泛素连接酶。VHL可以对HIF1α多聚泛素化,从而导致HIF1α的降解。此类PROTAC可用于降解雌激素相关受体、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶等。

伊马替尼、伯舒替尼和达沙替尼是酪氨酸激酶抑制剂,可抑制c-Abl激酶和BCR-Abl。最近,有研究者通过将这些抑制剂用不同类型肝连接链与VHL配体或CRBN配体连接,建立了一个PROTAC库。研究表明,连接链的性质,如长度、亲水性和刚性等会显著影响PROTAC的活性,而且靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体的选择也对PROTAC的功能具有重要影响。采用VHL配体时,基于伊马替尼和伯舒替尼的PROTAC不能引起c-Abl和BCR-Abl的降解,而基于达沙替尼的PROTAC却能降解超过65%的c-Abl。用泊马度胺作为CRBN配体时,基于伯舒替尼的PROTAC可以降解超过80%的c-Abl和BCR-Abl。

二、PROTAC分子设计研究进展[2]、[3]

目前,大多数的PROTAC设计和优化主要是通过靶蛋白与PROTAC之间的二元相互作用来指导的,通常是选择已有蛋白-配体共晶型结构的抑制剂进行设计,较为常见的设计思路是:选择特异性抑制剂,确定其处于蛋白口袋的表面(溶剂暴露)且不影响抑制功能的位点,延伸出一段柔性链以连接E3连接酶配体,保证抑制剂在PROTAC分子中的结合蛋白能力不受影响,从而招募泛素化分子至蛋白表面。由于目前对三元复合物的认识很少,而二元复合物则有大量晶体结构可供参考,这种设计思路在一定程度上行之有效。但最近的研究证明了这种方法的缺点,改进的二元亲和力不一定转化为改善的靶蛋白降解效能。

尽管PROTAC已成功靶向多种蛋白,但尚未提出一般的PROTAC设计策略。三元复合物的稳定性受亲和力、连接体(Linker)结构、E3连接酶的种类等多种因素的共同影响,增加了PROTAC设计的难度。另外,从现有抑制剂中选取与蛋白结合的部分,显然限制了PROTAC靶向“不可成药”蛋白的优势。寻找“不可成药”蛋白质的合适配体、发现更多的E3泛素连接酶类型是扩大PROTAC应用领域的必由之路。PROTAC未来的设计应当基于三元复合物的热力学和动力学性质以及对其整体结构的研究展开。

由于PROTAC分子量相对较大,有时会影响其成药性。因此,进一步降低PROTAC的分子质量、分子刚性、提高其细胞膜透过性、寻找合适的靶蛋白配体、更多样化的E3连接酶、改善其口服给药的生物利用度和组织分布以及如何预测其正确的给药剂量、三聚体复合物的形成、防止脱靶效应等都是PROTAC分子设计亟待解决的重要问题。

PROTAC分子设计中,应当主要考虑以下几个方面的问题:

1、连接位置需要根据小分子与靶蛋白的复合物晶体结构进行确定,以确保连接链不会影响到配体与靶蛋白的结合,同时还要考虑当靶蛋白与E3泛素连接酶拉近时,靶蛋白上相应的位置是否有赖氨酸以便使其泛素化。

2、连接链长度和组成不能影响PROTAC分子的溶解性和透膜性。

3、E3泛素连接酶的选择性应当与靶点蛋白相对应。

4、综合考虑体内蛋白的再生过程和去泛素化过程,降解速率需高于靶蛋白的再生速率。

三、小分子PROTAC作用靶点研究进展[4]、[5]

最初的多肽类PROTAC分子存在着较大的跨膜与药效等问题。故目前的研究重点大多在小分子PROTAC上,其分子设计的E3泛素连接酶配体部分多选用鼠双微基因(MDM2)、细胞凋亡抑制蛋白(cIAP)、希佩尔-林道蛋白(pVHL)Cereblon(CRBN)的配体,主要作用于以下靶点:

以核内蛋白为靶点

细胞核内存在的蛋白质包括核受体、组蛋白等。核受体是后生动物中含量最丰富的转录调节因子之一,在新陈代谢、性别决定与分化、生殖发育和稳态的维持等方面发挥着重要的功能。组蛋白是染色体基本结构蛋白,它的修饰与基因表达调控密切相关。

核内蛋白在遗传及蛋白质合成中起着决定性作用,多数疾病的发生发展与核内蛋白的异常表达及调控密切相关。目前已报道的PROTAC小分子多以核受体超家族及溴结构域和额外末端家族为靶点,主要是雄激素受体、雌激素受体、溴结构域和额外末端(BET)蛋白家族、周期蛋白依赖性激酶(CDK)BCR-ABL融合蛋白、B细胞淋巴瘤6蛋白(BCL6)等。

以跨膜蛋白为靶点

目前报道的以跨膜蛋白为靶点的PROTAC分子数量有限,且大多都是以受体酪氨酸激酶为靶点,如间变性淋巴瘤激酶(ALK)、上皮生长因子受体(EGFR)、人类表皮生长因子受体2(HER2)c-间质上皮细胞转换因子(c-Met)等。

以胞浆蛋白为靶点

细胞质是生命活动的主要场所,进行各种各样的生化反应,胞浆中存在着多种激酶参与到细胞生命活动调控的各个通路,并发挥着重要的作用,它们的异常上调会导致信号通路的异常,从而导致疾病的发生。PROTAC小分子针对的胞浆蛋白主要有布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、鼠双微子2(MDM2)等。

以病毒蛋白为靶点

目前,绝大多数成功的抗病毒药物都是直接作用于病毒的药物,包括能治愈丙型肝炎病毒(HCV)并使其长效的药物。其中,直接作用于病毒的药物最常见的靶标是病毒聚合酶和蛋白酶,因为它们具有确定的酶活性,并且数十年的抗病毒药物发现经验为这些靶蛋白找到了各种类别的配体分子。

哈佛医学院课题组利用靶向蛋白降解技术开发出一类新的PROTAC抗病毒分子,其可诱导病毒蛋白酶体降解。该药物是一种与HCV蛋白酶活性位点结合的可逆共价抑制剂,与CRL4CRBN的配体组合的PROTAC分子既能抑制又能诱导HCV的NS3/4A蛋白降解。优化后的PROTAC分子在细胞感染模型中能有效抑制HCV,证明了蛋白降解有助于其抗病毒活性。研究者还证明,这种新型抗病毒PROTAC分子可以克服病毒变异,解决了对传统蛋白抑制剂的耐药性问题。该研究成果验证了靶向目标蛋白可能成为开发针对耐药病毒的新药提供新的解决方案。

四、光控蛋白降解技术研究进展[6]

尽管PROTAC有许多优点,但如果目标蛋白同时在病变细胞和正常细胞中都具有功能或脱靶,PROTAC药物可以导致所有细胞内的目标蛋白降解消失,从而带来严重的安全性风险,产生严重的毒副作用。因此,需要对现有PROTAC技术进行改进、完善,防范蛋白降解剂的安全性风险。光控蛋白降解技术就是一种理想的解决方案,它是一种具有时空定位作用的PROTAC技术,在组织或细胞中实现局部精准的PROTAC的活化,从而避免其发生毒副作用。

实现药物的定位作用最常用的一种方式就是光控。纽约大学Dirk Trauner教授团队发展了一个光控的靶向蛋白质降解技术(PHOTAC),其核心为一个三功能小分子,除了PROTAC技术原来的两种功能以外,进一步引入了偶氮苯的结构作为光开关,从而实现可控的靶向蛋白质降解。偶氮苯机构是最小的光控开关,作为取代基是基本不会增加药物的分子量,且具有很好的生物兼容度,可预测的几何变换以及易调节的光热特性。因此该研究团队对常规反式更稳定的偶蛋白以及顺式更稳定的二氮芳辛类化合物,以及将这些光控基团插入功能分子的不同位置的小分子进行筛选。

该研究团队首先选择应用最广泛的CRBN作为靶向的E3泛素连接酶和BET蛋白BRD2-4的高效抑制剂(+)-JQ1作为模型,合成了13个小分子进行尝试,发现PHOTAC-I-3具有最好的效果,在390nm光激活条件下有7倍EC50的降低。研究团队进一步在RS4;11细胞中利用蛋白免疫印迹法证明了对于BRD2-4的靶向降解,可以看到在24小时内蛋白被持续降解,C-MYC的下调,以及PARP被切割的部分增加,这种细胞凋亡信号的产生也与细胞活力实验中检测的相吻合,而黑暗处理条件下c-MYC水平的下降可能是由于(+)-JQ1衍生物PHOTAC-I-3抑制BRD4产生的。研究团队为了证明该技术的普适性,进一步结合了FKBP的合成配体SLF,合成了光控小分子,并进行了与前面相同的实验验证,证明光控靶向蛋白降解技术(PHOTAC)具有普适性。

光控蛋白降解技术(PHOTAC)实现对靶向蛋白降解的精确调控,避免蛋白降解剂发生毒副作用,在蛋白降解剂药物研发领域取得重大突破,具有理程碑意义,将极大地促进疑难杂症、罕见病、严重危害人类生命健康的重大疾病治疗药物的研发。

五、PROTAC在研品种及研究进展情况

1、ARV-110和ARV471是研发进展最快的两款PROTAC小分子药物,已经进入I期临床试验,目前已公布I期临床试验的安全性和药代动力学研究数据,在人体内具有良好的耐受性和药代动力学性质,由于受新冠肺炎疫情影响,其临床有效性数据暂缓公布。

2、针对IRAK4在先天免疫中起的重要作用设计的PROTAC小分子化合物,临床前研究结果显示可有效降低皮肤和脾的IRAK4水平,减少皮肤变厚,循环Th1和Th17细胞因子达到局部激素治疗水平,口服给药具有良好耐受性和药代动力学性质。

3、针对STAT3开发的PROTAC小分子化合物KYM-003,细胞实验结果表明,可以连接E3连接酶和靶蛋白形成三元复合物,并且高选择性降解STAT3,动物实验结果表明,单次口服KYM-003,24小时内STAT3总水平下降了90%,重复给药显示剂量依赖性抗肿瘤活性,具有良好的耐受性和药代动力学性。预计在2021年底之前向中国/美国递交1个IND,在2023年底之前再向中国/美国递交2~3个IND,开始临床试验。

4、基于CRBN靶向降解BRD4的PROTAC分子,目前尚未见相关研究数据。

5、针对免疫系统相关疾病治疗的PROTAC分子,目前尚未见相关研究数据。

6、针对BTK的口服PROTAC分子,预计2020年第三或第四季度向FDA递交IND。

7、针对CBL-B连接酶的PROTAC分子,可以刺激T细胞活化和IL-2分泌。目前尚未见相关研究数据。

8、针对HCV的PROTAC,已完成分子设计和成药性评价。

六、国内外PROTAC主要研发机构情况

国外主要研发机构

1、Arvinas

该公司由PROTAC鼻祖Crews教授于2013年创建,建立了基于PROTAC开发小分子药物的技术平台,其研发的两款PROTAC药物已进入I期临床试验。

2、Kymera

该公司成立于2016年,位于美国麻省剑桥市,致力于发展蛋白降解技术,建立了独特的Pegasus平台,该平台可利用生物信息学驱动靶标的发现、建立的E3连接酶库、拥有先进的蛋白降解检测手段和高水准的结构生物学模型。其有数个PROTAC分子已完成临床前研究,即将进入临床试验。

3、C4 Therapeutics

该公司由哈佛大学的三位教授于2015年共同创立,致力于抗肿瘤、神经系统疾病和其他由蛋白所致重要疾病的PROTAC药物研发。

4、Vividion

该公司成立于2015年,其核心技术主要来源于Scipps研究所,致力于“难成药”靶点的PROTAC药物研发,重点关注免疫相关疾病,预计在未来4~5年内,将有4~5款PROTAC药物进入临床试验。

5、Nurix

该公司成立于2009年,位于美国加州旧金山市,三位创始人都是研究E3连接酶的知名学者,创建了独特的E3连接酶技术平台,利用DEL高通量筛选E3连接酶配体,通过利用/抑制E3连接酶,调控靶蛋白。其研发的针对BTK的PROTAC药物,预计在2020年底前向FDA递交IND。

6、Oncopia Therapeutics

该公司成立于2017年,针对STAT3的PROTAC预计在2021底之前向中国/美国递交IND,在2023底之前还将有2~3个PROTAC药物向中国/美国递交IND。

7、Cedilla Therapeutics

该公司由哈佛大学的三位教授和加州大学的二位教授共同创建,通过不同靶点的降解动力学选择调控点来降低其稳定性,从而被细胞内已有的降解机制发现、降解,他们使用传统的小分子药物设计PROTAC,目前有8个早期项目正在进行中。

8、Cullgen

该公司成立于2018年,拥有自己的UsmiteTM技术平台,其最新研究实现了光诱导PROTAC技术治疗肿瘤。

9、Novartis

Novartis生物医学研究中心已经成功针对40多个靶标诱导靶向降解,其中很多靶标曾经被认为不可成药。

10、Amgen

领导该公司开展PROTAC研发的是PROTAC技术创始人之一的Raymond,已研发出一种在细胞和动物层面都有效的PROTAC。

国内主要研发机构

1、药明康德

药明康德主要与Arvinas公司、Kymera公司合作开展PROTAC研发。

2、凌科药业

该公司成立于2017年,位于杭州市,聚焦肿瘤与免疫疾病小分子PROTAC药物研发。

3、分迪科技

该公司成立于2014年,建立了PRODEDTM小分子靶向蛋白降解新药研发平台,将蛋白降解和免疫自调节机制相结合,并将人工智能、分子模拟和组合化学等技术应用于免疫新疗法的小分子新药开发中。

4、开拓药业

该公司成立于2009年,其PROTAC药物还在设计、筛选、确认阶段。

5、五元生物

该公司成立于2015年,位于南昌高新区,其主要方向是利用人工智能类器官技术促进新的药物靶点的发现和验证,并为PROTAC分子提供有效性和安全性评估,降低新药研发时间和成本,提高新药研发成功率。

6、海创药业

该公司成立于2013年,位于成都市,其针对耐药性晚期前列腺癌的PROTAC药物正在进行临床前研究。

7、志美医药

该公司成立于2017年,位于上海,专注于运用PROTAC技术开发具有自主知识产权的新药,已建立多条抗肿瘤PROTAC药物研发管线,已累计申请10项涉及PROTAC的专利。

8、恒瑞医药

2019年7月,恒瑞和上海宏创医疗科技有限公司收购了专注于开发E3连接酶抑制剂的Princeps Therapeutics 31%的股权。

 

文献资料

[1] 孟一帆等,诱导蛋白降解的小分子PROTAC的研究进展,广东化学,2018,45(5)125~126

[2] 梁倩倩等,PROTACs靶向蛋白降解技术及其在合理药物设计中的应用,中国新药杂志,2019,28(4)442~450

[3] 冯序乐等,基于靶向蛋白降解技术的药物研究进展,合成化学,2018,26(12)939~944

[4] 王媛等,小分子PROTAC在不同靶点研究中的应用,药学学报,2020,55(3)446~452

[5] Priscilla L.Yang et.al Small molecule degraders of the hepatitis C virus protease reduce susceptibility to resistance mutations,Nature Communications 10,Article number : 3468(2019)

[6] Dirk Trauner et.al PHOTACs enable optical control of protein degradation,Science Advances,21 Feb 2020 : Vol. 6, no. 8, eaay5064 DOI: 10.1126/sciadv.aay5064


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