药物治疗是保护人类生命安全和身体健康的重要方法和手段。但生命科学的研究是一个不断探索发展的过程，一些复杂疾病由于对其病因病机认识的不足以及药物技术的限制而难以治愈；一些新病原体引发的新疾病，特别是新病毒感染性疾病引起的突发重大公共卫生事件，对人类的生命安全和身体健康造成严重威胁。因此，除了在生命科学和医学领域不断增强基础研究及转化医学研究外，药物技术的突破将成为复杂疾病治疗和突发重大公共卫生事件处置的有效途径，药物研发已成为公共安全体系的刚需。

细胞是生物体结构和功能的基本单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒生命活动也必须在细胞中才能体  现。蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。人类的许多疾病与蛋白质的异常表达有关，因此，靶向蛋白的药物治疗对于疾病的防治具有极其重要的意义。

药物发现的经典方法通常是开发能识别并能调节靶蛋白活性的高亲和力抑制剂，通过与靶蛋白结合位点结合并占据靶蛋白结合位点而发挥抑制靶点的功能，这种策略对于许多靶点都非常成功。但大多数蛋白质缺乏有效的结合部位以及合适的化学物质，致使80%～90%的人类蛋白质组“不可成药”。小分子药物的发现一直在寻找解决“不可成药”蛋白的方法。

靶向蛋白质降解（TPD）因具有高度选择性和有效性在过去十几年引起了化学生物学和药物研究领域的极大兴趣，成为药物研发领域的一个新兴方向，为疾病的防治提供了一种全新的方案。

自从人类基因组被解读以来，研究人员就在试图靶向成千上万导致疾病的蛋白。但是他们发现传统的小分子和抗体药物只能靶向大约20%的蛋白。这一局限性给了基于RNA的药物和基因编辑技术很大的发展空间，因为它们有可能靶向另外80%的蛋白。但是这些新技术也需要面对一系列挑战，其中包括药物递送问题、药效和安全性问题。

蛋白靶向降解药物力图将小分子设计成为一种新型药物，传统小分子的作用是阻断蛋白的功能，而蛋白靶向降解剂的作用是通过将这些蛋白送入蛋白酶体  将它们完全降解，具有高度选择性和有效性。通过诱导靶蛋白的降解，靶蛋白降解剂可以表现出与抑制剂不同的生物学特性。在不是很远的未来药物研发中，寻找小分子靶蛋白降解剂而不是抑制剂将成为一种普遍的策略，这种新兴药物具有的巨大发展前景，将开创药物研发的崭新时代。这是一个伟大而激动人心的时代，我们可以在这个时代致力于靶蛋白降解技术的研究并积极地进行下一代小分子药物的开发。

一、蛋白降解机制

天然蛋白的降解主要通过细胞膜中的泛素-蛋白酶体系统和自噬性溶酶体二个途径发生。

（一）泛素-蛋白酶体系统

泛素－蛋白酶体系统（UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。

泛素-蛋白酶体系统蛋白降解途径是一个多步骤反应过程，有多种不同蛋白质参与。蛋白质先被泛素（多肽）标记，然后被蛋白酶体识别和降解。通过这样一个需要消耗能量的过程，细胞以高度特异方式对不需要的蛋白进行降解。

泛素-蛋白酶体系统包括泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素-蛋白连接酶E3、蛋白酶体及其底物和泛素解离酶。

1、泛素-蛋白酶体系统的结构

泛素-蛋白酶体系统由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成。

（1）泛素：含有76个氨基酸残基，分子量约8.5kDa，广泛存在于真核细胞（原核细胞中尚未发现）。泛素链与蛋白底物的结合形成被蛋白酶体降解的识别信号。另外，泛素化在蛋白的内吞和外泌作用中有目标定位功能。（2）泛素活化酶E1：通过半胱氨酸残基与泛素C端活化的甘氨酸残基形成硫酯键，E1-泛素中间体中的泛素可以转移给数个E2。

（3）泛素结合酶E2：以泛素结合酶方式起作用，活性部位为半胱氨酸，部分E2成员在细胞特定过程中发挥作用，但E2的全部作用尚不清楚。

（4）泛素连接酶E3：为泛素-蛋白酶体系统选择性降解机制的关键因素，识别被降解的蛋白并将泛素连接到底物上。

（5）蛋白酶体（2.5MDa）：由2个19S和1个20S亚单位组成的桶状结构，19S为调节亚单位，位于桶状结构的两端，识别多聚泛素化蛋白并使其去折叠。19S亚单位上还具有一种去泛素化的同功肽酶，使底物去泛素化。20S为催化亚单位，位于两个19S亚单位的中间，其活性部位处于桶状结构的内表面，可避免细胞环境的影响。酵母20S亚单位由四个环状结构（αββα）组成。

2、泛素-蛋白酶体系统的作用

泛素-蛋白酶体系统是细胞内一系列生命进程的重要调节方式，与疾病的发生发展关系密切。研究证实，泛素-蛋白酶体系统在心血管疾病中具有重要的病理生理学意义，可调节动脉粥样硬化、缺血后再灌注损伤、家族性心肌病、心肌肥厚和心脏衰竭等重要疾病的发生和发展。另外，最新的研究表明，泛素-蛋白酶体系统的重要作用还在于其被充分利用后，可以代谢诸如毒素、脂肪、癌细胞在内的人体垃圾，另外代谢产生的能量可刺激细胞进行自我复制以完成人体的自我代谢修复功能。

（二）自噬性溶酶体

自噬性溶酶体又称胞溶酶体，它是初级溶酶体与来自自噬作用的含有内源性物质的囊泡即自噬体融合或溶酶体吞噬细胞质而形成，在细胞内起“清道夫”作用。

1、自噬性溶酶体的形成

细胞内由于生理或病理原因而被损伤的细胞器，或过量储存的糖元等，它们可被细胞自身的膜（如内质网或高尔基复合体的膜）包裹形成自噬体，自噬体与初级溶酶体接触，两者融合形成自噬性溶酶体。

自噬性溶酶体也可以通过溶酶体本身的内陷，并包围一部分细胞质成分而成（但一般较少）。在自噬性溶酶体内的内源性物质被溶酶体的酶消化分解的过称为自噬。

2、自噬性溶酶体的作用

自噬性溶酶体是一种自体吞噬泡，作用底物是内源性的，即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。这种溶酶体广泛存在于正常的细胞内，在细胞内起“清道夫”作用，作为细胞内细胞器和其它结构自然减员和更新的正常途径。在组织细胞受到各种理化因素伤害时，自噬性溶酶体大量增加，因此对细胞的损伤起一种保护作用。

自噬性溶酶体的作用底物是内源性的，即来自细胞内的衰老和崩解的细胞器或局部细胞质等。它们由单层膜包围，内部常含有尚未分解的内质网、线粒体和高尔基复合体或脂类、糖原等。正常细胞中的自噬性溶酶体在消化、分解、自然更替一些细胞内的结构上起着重要作用。当细胞受到药物作用、射线照射和机械损伤时，其数量明显地增多。在病变的细胞中也常可见到自噬性溶酶体。

二、蛋白靶向降解药物作用机制

基于机制的药物发现是当今药物开发的主流方式，其核心是寻找和发现可靠的药物靶标。发现和确证药物靶标是基于机制开发新药的前提条件和决定性因素。长期以来，制约基于机制的药物发现的主要困难是缺乏可靠的生物学靶标。

随着人类基因组计划的完成，以及与之伴生的基因组学和蛋白质组学的理论及实验结果分析技术的快速发展，疾病相关 靶标的发现与确证速度越来越快，有不少非酶蛋白被确定为药物靶标，这些新鉴定确证的生物学靶标与特定疾病的关联性更强，极大地拓展了创新药物研究的可能靶标范围。但是，这些新鉴定确证的非酶靶标难以用传统的、基于机制的、通过占据活性位点的调控方式来发现和设计疾病治疗药物。与传统的基于生物学功能鉴定出的靶标不同，基于组学分析鉴定出的靶标中有许多非酶蛋白，如转录因子、骨架蛋白等。这类靶标相较于传统的药物靶标，如酶、G蛋白偶联受体和离子通道等有较大的不同，通常不直接执行具体的功能，且缺乏明显的活性位点。

对于传统的靶标蛋白，小分子药物可通过与蛋白的活性位点结合，直接阻断其特定的功能发挥治疗作用。而这些非酶蛋白通常不具备直接的生物学功能，难以通过结合和占据靶标的特定位点而直接调控其活性。因此，传统意义上认为这类蛋白质为“不可成药‘’靶标，从而极大地限制了快速增加的此类靶标在创新药物研发中的运用。

对于一些复杂疾病，即使靶向目前认为“成药”的靶标，现有基于机制的药物由于只占据一个或几个活性位点，而存在药效和耐药性等问题，使疾病的治疗受到限制。因此，无论是针对传统的“成药”靶标，还是针对新兴的“不可成药”靶标，都亟需发展一种新型技术，使疾病能够得到有效治疗。

靶向蛋白降解剂就是一种新型技术，它通过劫持内源性蛋白质降解机制（泛素-蛋白酶体系统或自噬性溶酶体）来诱导蛋白质进行降解，只需一个结合剂来招募目标蛋白（并不需要高亲和力抑制剂），从而有可能瞄准不可治疗的蛋白质组。除了治疗潜力，蛋白质降解剂还是验证靶标且深入了解蛋白质功能和细胞途径的有效工具。

与RNA或基因组编辑工具相比，靶向蛋白降解剂的一个优点是目标蛋白的急性和快速消耗避免了不必要的适应事件，并且能够以反复循环的周期率进行消耗；与RNAi、反义寡核苷酸或基因组编辑等基于核苷酸的方法相比，靶向蛋白降解剂由于体内稳定性和生物利用度较低而受到应用限制。因此，不断发展和完善靶向蛋白降解技术，对于新型药物的研发具有重要意义。

三、靶向蛋白降解类型

目前，靶向蛋白降解主要分为标记靶蛋白的降解和未标记靶蛋白的降解两大类。

已标记靶蛋白的蛋白质标签主要包括肽序列或蛋白质，它们与目标蛋白质（POI）融合无需识别合适的结合物，如小分子、肽或抗体，此类降解需要预先修改靶细胞/生物体的基因组来限制标记靶蛋白的降解，主要应用于化学生物学和靶点验证研究领域，在创新药物研发领域也有极其广阔的应用前景。

未标记靶蛋白降解依赖于确定合适的靶标结合物，它因独立于生物体的基因改变而更具有普适性。

（一）标记靶蛋白的降解

通过控制蛋白质活性和丰度来更好地理解和验证靶标是一种非常强大的方法。在药物开发的目标发现和验证阶段，通常没有合适的结合物用于降解内源性蛋白质。通过融合一个蛋白质标签到目标蛋白质来实现对标记蛋白质的选择性识别。可在目标蛋白质的N-或C-末端引入短氨基酸序列或蛋白质结构域的各种标记，一些标记仅允许对靶标蛋白进行选择性寻找，另一些则直接导致其降解。为了减少对系统的干扰，蛋白质标签应使用CRISPR/Cas等基因内插入到宿主基因组中的方法，也可以考虑其他方法，如以瞬时或稳定的方式转染/转导DNA编码质粒等。

标记靶蛋白的降解主要有蛋白降解子、标签特定的降解剂、纳米抗体诱导靶标降解等。

1、蛋白降解子^[1]

蛋白质的正常表达及降解对维持细胞功能平衡至关重要，当蛋白质功能异常或生物合成等发生错误时，会被识别、标记并被迅速降解，从而保证细胞生存环境的稳定。细胞内的蛋白降解，依赖于蛋白酶系统对特定氨基酸序列或构象变化的识别。由泛素-蛋白酶体系统（UPS）自然降解的蛋白质显示出特定降解信号，称为蛋白降解子（Degron），它代表E3连接酶结合的基序。蛋白降解子是蛋白上包含的一段特定氨基酸序列，可被细胞内的蛋白酶识别，以介导蛋白的降解清除。大多数蛋白降解子存在于编码蛋白的DNA序列中，少数是在翻译过程中或翻译后添加到靶蛋白上，蛋白降解子通常位于蛋白的N末端或C末端，因而容易被蛋白酶或其他连接蛋白识别并结合。相对于蛋白C端的降解信号，蛋白N端附近的序列与降解的相关性更为密切，有时N端一个氨基酸的改变甚至可以使蛋白质对蛋白酶变得敏感，称为N端法则。N端法则主要存在于泛素-蛋白酶体系统降解途径中，通过N末端特定氨基酸残基以及翻译后修饰（PTM）共同影响蛋白质的体内半衰期。

蛋白降解子能快速并可逆诱导体内蛋白降解。通过与目的基因进行结合，蛋白降解子可以靶向调控几乎任何蛋白的表达，成为研究蛋白功能及信号传导等细胞分子机制的利器。蛋白降解子范围从单个氨基酸到短肽序列或结构域，并且可以在蛋白质之间转移。因此，在任何类型蛋白上加上一个蛋白降解子都会导致其降解。许多能被小分子、光或温度激活的蛋白降解子已成功诱导靶蛋白降解。

蛋白降解子是蛋白质的一部分，存在于各种生物体中。虽然有许多不同类型的蛋白降解子，并且即使在同种类型的蛋白降解子中存在高度变异性，但它们在调节蛋白质降解速率方面都是相似的。

（1）蛋白降解子的种类

迄今为止，基于蛋白降解子原理开发的蛋白降解系统已有多种，依据其诱导方式，大致可分为小分子诱导、温度诱导、光诱导三种蛋白降解子系统。

①小分子诱导的蛋白降解子系统

小分子诱导蛋白降解子系统是指利用一些生物激素或化学小分子物质来控制蛋白降解子的活化，主要有正向激活的蛋白降解子和反向调控的蛋白降解子，其中，植物激素诱导的蛋白降解子系统AID是小分子诱导正向激活的蛋白降解子的典型代表，小分子辅助开关SMASh是小分子诱导反向调控的蛋白降解子的典型代表。

目前，已被应用的蛋白降解子系统有植物激素诱导蛋白降解子（AID）、不稳定域（DD）、配体诱导的降解（LID）、烟草病毒蛋白酶诱导的蛋白质失活（荧光蛋白的降解（deGradFP）、小分子辅助开关（SMASh）、泛素破坏降解（SURF）等。

②温度诱导的蛋白降解子系统

温度诱导的蛋白降解子系统（ts-Degron或TSD）目前主要是通过从小鼠中克隆的二氢叶酸还原酶（DHFR）的一种突变来实现，利用其对温度的敏感性来激活蛋白降解子。该系统不仅反应快速，而且可逆，仅需改变温度条件即可诱导蛋白降解子，因而可方便地用作调控细胞内蛋白质水平的快速开关系统。

③光诱导的蛋白降解子系统

光诱导的蛋白降解子系统（PSD或B-LID）包括从拟南芥中克隆的光-氧-电压（LOV）调控系统，以及来源于小鼠的鸟氨酸脱羧酶（ODC）系统，其原理一般是通过光来诱导特定光敏蛋白构象变化或去离子化，并进而影响与其相连接的蛋白降解子结构变化，由非活性构象转化为活性构象，进而导致融合蛋白被蛋白酶体降解。目前，光诱导的蛋白降解子已被用于线虫等生物体。基于光遗传学在神经科学研究中的重要性，光控制的蛋白降解子可能在这个领域有巨大应用前景。

（2）蛋白降解子的生理功能及应用

蛋白降解是细胞内蛋白调控的核心功能之一。近年来发展起来的蛋白降解子技术在蛋白调控、细胞信号传导机制研究以及基因治疗药物开发等领域具有巨大的潜在应用价值。

癌症的产生是大量基因突变积累的产物，超过一半的癌症中含有p53基因突变。同时，癌症中基因也常表达异常，出现基因重复、染色体非整倍性或重构，导致原癌基因表达上升以及抑癌基因表达下降。鉴于大多数降解子是嵌入在模块蛋白质序列的短序列，属于蛋白质丰度的调节位点，因而对于许多细胞过程的调控（如调节细胞周期和监测细胞代谢）极为重要。此外，降解子能消除不需要的蛋白质，防止其可能导致的细胞功能障碍，癌基因表达的增强和抑癌基因丰度的减少均与蛋白质降解机制相关。因此，了解蛋白质降解机制对于许多疾病，尤其是癌症显得至关重要。

蛋白降解子不仅对癌症等疾病治疗有潜在的重要应用，还可以作为其他分子技术的辅助工具，如基因编辑技术等。需要指出的是，人类蛋白质中已知约存在600个E3连接酶，但目前仅定义了大约28种类型的蛋白降解子基因序列。对蛋白降解子的深入研究，不仅将促进基础生物学机制的研究，在药物开发领域也有广阔的应用前景。

2、标签特定的蛋白降解剂

标签特定的蛋白降解剂是一种非常强大的工具，能快速实现一系列目标蛋白的靶向降解，而不需要识别一个特定的结合物。在这种情况下，蛋白降解分子被优化以接合蛋白标签，从而去除目标蛋白融合结合物，目前广泛使用的两个主要标签是HaloTag和dTag体系。

HaloTag是一种自标记标签，它共价结合到氯代烷烃上，可以使用所选择的合成配体对HaloTag蛋白进行高选择性共价标记，将E3连接酶结合物连接到氯代烷烃卤代标记配体可导致目标蛋白结构的选择性有效降解。迄今为止，卤代标记蛋白降解剂被设计用于劫持VHL和IAP E3连接酶。它们在低纳米摩尔范围内能有效地诱导过表达模型中的融合蛋白降解，并与内源性CRISPR-Cas基因相结合。由于卤化物蛋白降解剂的共价性质以及随后与目标蛋白一起从系统中去除，因此必须按化学计量使用。

相比之下，使用dTag系统可实现二价降解剂的亚化学计量以实现全目标蛋白降解。dTag方法包括融合到目标蛋白的FKBPF36V蛋白标签和二价降解剂分子（dTag）。dTag在一个位点选择性地与FKBP结合，在另一个位点与E3连接酶CRBN结合，从而诱导融合蛋白结构物的降解。dTag方法已在各种疾病模型中多次用于靶点验证。与HaloTag系统相比，dTag具有催化作用，并且已经证明在体内外应用中都有效。

3、纳米抗体诱导靶标降解

实现选择性蛋白降解的另一个策略是基于融合到E3连接酶的基因编码纳米抗体。这项技术通常使用特定的纳米抗体降解绿色荧光蛋白-目标蛋白融合结构。纳米抗体来源于骆驼类物种，是一种小的单链多肽抗体，可以针对不同的抗原进行培养。这些降解剂直接针对目标蛋白本身，从而允许基因编码标签不被诱导降解。