反向遗传学技术在疾病研究中的应用
发布时间:2020-06-12 09:29:39 | 来源:【药物研发团队 2020-06-12】
反向遗传学是通过定点突变某基因,研究其表型来确定该基因的功能的遗传学研究方法,是直接从遗传物质入手研究生命现象与规律。在现代遗传学中,反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具,它彻底改变了人们对疾病发病机制和药物及疫苗开发的认识,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
经典遗传学的认知路线为由表及里,即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化。随着分子遗传学及相关实验技术的发展,已经能够在分子水平上进行操作,有目的地对DNA进行重组或者定点突变等。因此,现代遗传学中就出现了另一条由里及表的认知路线,即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。由于这一认知路线与经典遗传学刚好相反,故将这个新的领域作为遗传学的一个分支学科,称为反向遗传学。
例如,将报告基因,即编码易于检测的蛋白质或酶的某些基因,分别与某些待测的DNA片段重组,转染合适的细胞,通过测定报告基因的产物即可推断该片段在基因表达调控中的作用。
一、反向遗传学的研究对象
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
二、反向遗传学技术
与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术,包括RNA干扰(RNAi)技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等,是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。
(一)RNA干扰技术
RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默,主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录:PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
制备RNAi的方法主要有化学合成、体外转录、体内表达、siRNA表达载体、siRNA表达框架等。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达(长度超过30的dsRNA会引起干扰素毒性),所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
1、RNAi的作用机制
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应,其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21~23 bp),即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是,由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性,任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。研究发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。研究人员借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因,发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。
2、RNAi的特征
(1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制。
(2)RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。
(3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的。
(4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。
(5)dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡。
(6)ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
3、RNAi的生物特性
RNAi具有高效性、特异性、位置效应、竞争效应和可传播性等特点。RNAi抑制转座子活性两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关:
(1)发现蠕虫mut-7基因参与RNAi并且与转座子的转座抑制有关。
(2)在果蝇中,参与RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失,同时提高了反转录转座子活性。
(3)RNAi抵御病毒感染。在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现,sgs2/sde1基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性。
(4)RNAi参与异染色质的形成和维持。研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核;在敲除裂殖酵母(S.pombe)的RNAi途径基因(如Argonaute、Dicer、RDRP)时发现异染色质转录得到的dsRNA可以在RNAi途径的参与下,加工成siRNA,si RNA募集异染色质蛋白1(HP1),然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。
(5)RNAi参与机体的发育调控及生理代谢。RNAi只抑制转录后的基因,所以RNAi在生物体发育学研究中具有优势。研究人员用RNAi技术进一步证实了AG、CLV3、AP1、PAN等已知功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在RNAi过程中形成的RISC复合物可根据不同情况分别利用siRNA或stRNA行使不同的功能,但最终均导致特定基因沉默。
(二)基因沉默技术
基因沉默是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段,指的是真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞非正常RNA的一种机制。以前,“基因沉默”被理解为是真核生物染色体形成异染色质的过程。最近的研究表明,“基因沉默”与“异染色质”存在差异,尽管被沉默的基因区段也呈高浓缩状态,但“基因沉默”所形成的染色体构象并不完全等同于"异染色质“构象。除此之外,两者还存在着基因表达调控程度上的差异,一般认为处于"基因沉默“的染色质区的基因表达被”彻底“关闭,而”异染色质“状态的基因可能依然进行低水平的表达(转录)。RNA干扰与转录后基因沉默在分子层次上被证实是同一种现象。
1、基因沉默的原理
基因沉默需要经历不同的反应过程才能实现,包括组蛋白N端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰(由甲基转移酶催化,修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰,后者又被称为“过度”甲基化修饰)、以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质(MBP)形成“异染色质”,在上述过程中,除了部分组蛋白的N端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外,有时也需要在其他的组蛋白N端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰,尽管各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉默”失去转录活性。
2、基因沉默的作用
基因沉默是涉及组蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化,DNA的甲基化修饰,甲基化修饰组蛋白结合蛋白Sir2/3/4,甲基化DNA结合蛋白,非编码RNA等在内的一系列复杂组分的生理反应过程。基因沉默导致相应区段内的遗传信息不能被转录。
基因沉默是基因表达调控的一种重要方式,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制,在外源DNA侵入、病毒侵染和DNA转座、重排中有普遍性。对基因沉默进行深入研究,可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质,在基因克服基因沉默现象,从而使外源基因能更好的按照人们的需要进行有效表达;利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达,达到治疗疾病的目的,所以研究基因沉默具有极其重要的理论和实践意义。
(三)基因体外转录技术
基因转录通常发生在生物体内,如果将含有RNA转录酶、NTP等条件,在体外无细胞系统中,用DNA作为模板,模仿体内转录过程生成RNA,这样的技术则能够控制转录的基因、转录的过程和转录后RNA的用途,这种技术被称为基因体外转录技术。
三、反向遗传学研究的作用
反向遗传学是在已知基因序列的基础上,利用现代生物理论与技术,通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应。
反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能,阐述生物生命发生的本质现象与规律,如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。
(一)基因功能的研究
1、在基因测序完成后,最具有挑战性的工作就是确定所有基因序列的生物学功能,通过基因突变、删除等,利用反向遗传学方法来研究未知基因的功能已受到研究者的广泛关注。失活相关基因的功能,是物种形成的遗传学研究的良好工具。
2、用于基因的克隆测序与定位。用反向遗传学途径克隆新基因是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现,以图位克隆与转座子标签技术为常见。随着现代生物信息学的发展,出现了更为便捷的电子克隆方法。还可以用于研究细胞内DNA的同源重组,基因序列分析;可在DNA的分子水平上构建嵌合病毒以研究病毒基因组的基因功能。此外,反向遗传学技术也被用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用关系等方面。
(二)疫苗开发
反向遗传学的问世和发展为生产合适的疫苗株提供了可能,它可以消除那些非允许细胞系分离毒株可能带来的污染或其他病原体;通过对质粒进行操作,可以改造其他影响病毒毒力的基因,以去除那些致病因素。反向遗传学技术的应用,在设计和改进疫苗中发挥重要作用。
反向遗传学技术为研究开辟了全新的思路,利用该技术可以从分子水平上研究病原微生物的生活史,可以很容易地对病原微生物的复制及致病性分子机理进行研究,同时还可用于标记疫苗的研制。
反向遗传操作技术最具潜力、最吸引人的应用还是在于新型病毒疫苗株的筛选,其优越性一方面在于可以解决新型病毒感染导致的疫情大流行发生时疫苗生产的时效问题,另一方面可以快速为相关研究机构研究用的活病毒资源,以验证相关疫苗或治疗药物的有效性。
1、制备活病毒减毒疫苗
利用病毒反向遗传操作技术对RNA病毒的cDNA克隆进行点突变,已证实如登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和乙型脑炎病毒等一系列的毒力相关位点,通过基因突变、缺失、重排等方法,都有可能获得理想的减毒株来研制疫苗。与传统的细胞传代获得减毒株的方法相比,其具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点,是疫苗研制的新方向。
借助于登革病毒感染性全长克隆,通过定点诱变、嵌合和缺失突变等手段可得到人工定向减毒的登革疫苗候选株,而且在该减毒疫苗中病毒基因成分稳定,减少了传统减毒疫苗在传代培养中产生回复突变的危险。因此,感染性克隆技术不但阐明了登革病毒致病的分子机制,而且为其减毒疫苗的研制开辟了新途径。
2、制备标记疫苗
标记疫苗不同于普通弱毒疫苗,它不但应具备稳定、安全和长效等优点,同时在免疫接种后,诱导的抗体能与野毒诱导的抗体分开,即它带有可识别的标记。如含有一种足以诱导保护性免疫的某种病毒表面蛋白的亚单位疫苗,通过检测抗体是由标记疫苗产生的还是野毒感染产生的,可以及早有针对性地采取措施,这样一方面可以增强在实施疫情防控计划时的针对性,另一方面又可及早发现感染人群,以便及时采取措施控制疫情。构建可以用于鉴别诊断的标记疫苗是今后RNA病毒疫苗研究的一个方向。
3、制备疫苗载体
反向遗传操作技术在表达外源基因,寻找新型疫苗载体方面显示了非常好的前景。负链RNA病毒不具有DNA,因此不会把其基因组信息整合进宿主细胞,在安全性上具有很大优势。目前,很多外源基因均已在不同的克隆病毒上得到表达,如报告基因CAT在传染性呼吸道合胞体病毒、新城疫病毒、水泡性口炎等病毒上已得到表达。
(三)疾病治疗
RNA干扰可以特异地沉默与疾病有关的内源或外源基因,或者沉默致病过程中与一些中间代谢产物的合成、分解有关的蛋白基因,而不会对个体的生长发育产生影响,这些特性为RNA干扰在疾病治疗上的应用开创了广阔的前景。目前,已应用于肿瘤、糖尿病、脑血管等疾病的治疗。
(四)用于病毒研究
病毒是包膜和蛋白质构成的微小囊状物。囊体里有一条或多条DNA或RNA链,包含病毒复制所需的软件程序。病毒非生非死,存在于生命与非生命的边界。若处于细胞外,病毒只是存在而已,什么也不会发生,它们是死的,甚至能结成晶体。血液或体液中的病毒粒子或许看起来是死的,但病毒粒子只是在等待时机而已。它们的表面具有黏性。要是细胞凑巧经过,碰到病毒,病毒的黏性与细胞的黏性能够匹配上,病毒就会附着在细胞上。细胞感觉到病毒的附着,会包裹住病毒,将它拉入内部。一旦病毒进入细胞,就变成了特洛伊木马,它就开始活跃起来,开始复制。
病毒就像寄生虫,它无法自己生存,只能在细胞内进行复制,利用的是细胞的物质和运行机制。所有生物的细胞内都携带有病毒,甚至真菌和细菌也不例外,有时候还会被病毒摧毁。简而言之,疾病也有自己的疾病。病毒在细胞体内自我复制,直到细胞被病毒塞满和撑破,于是病毒涌出破裂的细胞。病毒也会穿透细胞壁出芽,复制,宿主的细胞死到一定数量,宿主就会死亡。
病毒并不“想“杀死宿主,因为杀死宿主无异于自杀,除非病毒能以足够快的速度从濒死宿主传播到新宿主上。病毒在繁殖时看起来是活的,但它又显然是死的—只是机器而已。病毒是分子大小的鲨鱼,它紧凑、冷酷、理性、只考虑自己,它的首要目标就是复制。
1、用于病毒基因组结构与功能的研究
利用反向遗传学,可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编码产物在病毒生命周期中的作用,为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。
2、用于病毒毒力及其致病性研究
现常应用病毒反向遗传操作技术来鉴定病毒某些蛋白的功能及进行致病性研究,如在负链RNA病毒上的一个应用,是通过去除某些病毒P基因编码的可选择的基因产物C蛋白和V蛋白,以此来评价它们在病毒复制和致病中的作用。而这一问题用经典的分子生物学技术难以解决。
3、RNA病毒的反向遗传学研究
RNA病毒的反向遗传学研究是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中克隆出活病毒或类似病毒物质。能够克隆病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被克隆的人工改造病毒的表型,可以在体内有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。
该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子,并使之受控于RNA聚合酶启动子,通过体外转录过程再次得到病毒RNA,然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可克隆出活病毒,由于这种克隆病毒是来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过克隆病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株,开发新型的疫苗。目前已有许多RNA病毒的全长感染性cDNA克隆构建成功。
综上所述,反向遗传操作技术在病毒基因功能定位、外源基因的表达、基因治疗和疫苗研制等许多方面都是强有力的工具和手段,将发挥越来越大的作用。
四、反向遗传学技术在疾病研究的应用
反向遗传学在疾病研究中的应用主要是反向遗传学技术的应用,包括RNA干扰技术、基因沉默技术和基因体外转录技术的应用。
当前,新冠疫情在全球肆虐,虽然新冠感染者病例大规模出现,但不同地域毒株常存在差异性,且出于生物安全的考虑,无法在全球范围内任意运输,导致众多科研机构由于缺乏新冠病毒活毒资源,无法快速充分地鉴定病毒,验证相关疫苗或治疗药物的有效性。
新冠病毒人工合成技术的突破,使得处于不同国家与地区的科学家,能够在各自所处的高等级生物安全实验室内,在大肠杆菌、酵母菌等基因工程常用微生物中,合成当前数据库里具有完整基因组序列的新冠病毒活毒株,这有助于解决相关药物评价的关键资源问题,将加快针对新冠病毒的检测、治疗和预防手段的研发。另一方面,人工合成病毒还为新冠病毒的毒力位点发现与作用机制等研究提供了工具。通过对新冠病毒进行基因敲除、突变以及其他加工修饰,研究这些基因改造对其致病性的影响,有助于深入了解病毒致病机制,发现可用作药物靶点的新型毒力基因。
此外,还可以给病毒加上荧光蛋白等可视化标记,实现病毒感染实时监控,从而优化现有新冠病毒的细胞与动物感染模型,更进一步为相关疫苗与药物高通量快速筛选提供方便。
目前,国内外科研机构合成病毒,尚无法脱离反向遗传学范畴。科研人员大都是基于在大肠杆菌或酵母菌等基因工程类微生物内,克隆与改造病毒遗传物质,然后将提纯的病毒基因组转运到宿主细胞中进行活病毒的组装生产。
近日,一项研究使用了反向遗传学方法,依靠已知的新冠病毒基因序列,在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒。该研究成果破解活毒资源不足,可快速鉴定新冠病毒并验证疫苗有效性
相较于灭活疫苗、减毒疫苗等经典疫苗的研发方法,反向遗传学操作还具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点,是疫苗研制的新方向。
目前,科研人员利用反向遗传学技术,已证实如登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和乙型脑炎病毒等一系列的毒力相关位点,通过基因突变、缺失、重排等方法,都有可能获得理想的减毒株来研制疫苗。
研究表明,基于反向遗传学技术的疫苗研究,还可以发现在经典疫苗研发过程中,难以发现的“特殊”保护性抗原,为传染性疾病的疫苗研制,以及发展新型多价或广谱疫苗提供新方向、新思路。
近年来,病毒的人工合成,将有助于人类了解病毒复制途径,找到其‘弱点’、药物靶点,是研制病毒相关疫苗与治疗药物不可或缺的技术手段。
当前,反向遗传学技术不仅在不同种类病毒研究上得到非常普遍的应用,而且在病毒疫苗和治疗药物研发上也展现出重要的应用价值。如基于反向遗传学技术改造合成减毒活疫苗的研究,已在包括2009甲型H1N1流感病毒、登革热病毒、禽流感病毒、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒等多种病毒中取得重要进展。其中,2009甲型H1N1减毒活疫苗已上市并广泛接种,水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒和登革热病毒等病毒的反向遗传改造减毒活疫苗,已进入临床试验阶段。
此外,基于反向遗传学技术合成的减毒病毒载体或溶瘤病毒类药物,已广泛用于基因治疗与肿瘤治疗临床研究。2015年,美国食品药品监督管理局批准首个溶瘤病毒药物T-VEC用于治疗晚期黑色素瘤;2017年,杜克大学研发的溶瘤脊髓灰质炎病毒治疗神经胶质瘤,获得了美国食品药品监督管理局的突破性疗法认证。
除了用于合成病毒,反向遗传学技术在细菌等其他微生物,以及植物相关研究上也有广泛应用,并取得了较大进展。在细菌研究方面,反向遗传学技术在B群脑膜炎球菌疫苗、肺炎链球菌多价疫苗、肺炎衣原体疫苗、炭疽杆菌疫苗等多种细菌性疾病疫苗的研制中,获得了成功应用。其中,B群脑膜炎球菌通用疫苗的成功研制是运用反向遗传学技术研发细菌疫苗的经典案例。
B群脑膜炎球菌是流行性脑脊髓膜炎的病原菌,可导致儿童和青少年患急性化脓性脑膜炎和败血症。然而长期以来,科学家们应用传统疫苗研发技术,难以攻克下“顽固”的B群脑膜炎球菌,研制有效和广谱的预防疫苗,一直无法获得成功。
直至2000年,随着基因组学和蛋白质组学技术的进步,诺华公司的研究人员应用反向遗传学技术原理,通过分析B群脑膜炎球菌的全基因组,并进一步通过基因组序列比较和动物模型测试筛选,研制出多价B群脑膜炎球菌通用疫苗。
2013年,诺华公司重组B群脑膜炎球菌疫苗获得欧盟委员会批准上市,成为欧洲第一个获得批准的预防B群脑膜炎球菌病的疫苗。该疫苗已在控制新西兰的B群脑膜炎球菌流行中被证明是安全和有效的。
(一)RNA干扰技术在疾病研究中的应用
1、RNAi在探索基因功能中的应用
人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现之前,基因敲除是主要的反向遗传学研究手段,但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达,所以RNAi已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立,使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能,对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。
2、RNAi在基因治疗领域中的应用
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HⅣ-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现,选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点,可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸激酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
3、RNAi在肿瘤治疗领域的应用
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。研究人员应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞,却不能有效的靶向肿瘤细胞,因此,在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡,实现靶向肿瘤细胞同样也是以RNA干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长,这些目标基因包括Bcl-2、survivin、EGFR、VEGF等。RNA干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,能高效地特异性抑制目标基因。与传统的方法相比,R NA干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显,其技术优势还在于能根据不同病情,设计个体化治疗方案。
已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因,其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达,不仅抑制了肿瘤细胞生长,而且减弱了其侵袭能力,为黑素瘤基因治疗奠定了基础。
研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素,其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外,剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。
4、RNAi在整形外科领域的应用
瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病,尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βⅡ型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和Ⅲ型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1,TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。
5、RNAi在病毒感染性疾病治疗中的应用
研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA,激发RNAi使其抑制了HⅣ-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞,而不影响另一种HⅣ-1主要的coreceptor-CCR4,从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答,由此治疗HⅣ-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫,用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。
在SARS病毒感染疾病的防治研究中,RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制,病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断,这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗,RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒感染性疾病的防治及突变重大公共卫生事件的防控具有十分重大的意义。
6、RNAi在遗传性疾病治疗中的应用
研究发现RNAi同脆性X染色体综合征(与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病)之间的关系密切,揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。
(二)基因沉默技术在疾病研究中的应用
基因沉默是基因表达调控的一种重要方式,是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制。基因沉默技术主要应用在药物研发以及肿瘤和病毒感染等疾病的临床治疗。基因沉默技术在膀胱癌治疗中取得了一定的进展。肿瘤细胞信号转导通路失调、生长因子及其相关受体、蛋白酶和后续调节因子可能成为特定的靶基因沉默。在抗病毒方面,基因沉默技术的应用也十分广泛。
(三)基因体外转录技术在疾病研究中的应用
大量研究表明,基因表达的调控发生在基因复制、转录、转录后、翻译和翻译后等环节。而基因转录的调控是逐级调控中最关键的环节,由于参与调控的因素有很多,调控的过程非常复杂,因此,在体内自然条件下,对基因的转录情况进行研究比较困难。
应用基因体外转录技术,可以快速检测目的基因的转录情况,分析转录因子调节基因转录的过程,分析启动子序列的活性,分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA剪切因子的组成和作用,确定DNA的转录起始位点,探讨染色质结构调整与基因转录的关系,制备RNA探针等。
1、获得具有感染性的拯救病毒RNA
由病毒的cDNA体外转录来获得拯救病毒是研究RNA病毒致病机制的有效手段。
2、获得小干扰RNA
小干扰RNA(siRNA)有时称为短干扰RNA或沉默RNA,是一个长20到25个核苷酸的双股RNA,在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰(RNAi)现象,以带有专一性的方式调节基因的表达。此外,也参与一些与RNAi相关的反应途径,例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径目前尚未明了。
目前,获得siRNA主要有三种方法,即化学合成法、体内转录法和体外转录法。化学合成法由于造价太高一般不被采用;体内转录法虽然具有明显优势,但仍局限于少数物种和细胞系。因此,目前干扰用siRNA的获得及高通量、大范围的应用仍以体外转录法为主。
3、获得锤头状核酶
锤头状核酶是一种可以进行可逆性剪接的RNA分子。由于其是小分子,结构分明以及剪切特性,经常被运用于RNA的结构与功能的研究中。应用基因体外转录技术,可以获得锤头状核酶。
4、获得脱氧核酶的底物mRNA
脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性和结构识别能力。自1994年首次发现脱氧核酶以来,迄今已发现了几十种脱氧核酶。根据其功能可分为7大类:具有RNA切割活性,具有DNA连接酶活性,具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性,具有DNA水解活性,具有DNA激酶活性,具有N-糖基化酶活性,具有DNA戴帽活性。脱氧核糖
酶的底物mRNA是获得脱氧核酶的关键物质。应用基因体外转录技术可以获得高纯度脱氧核酶。
5、获得在DNA芯片中作为内标的poly(A)+RNA
在DNA芯片技术中,通过反转录反应,由mRNA合成带有荧光标记物的cDNA的过程中,往往要加入已知质量的poly(A)+RNA,以对DNA芯片的检测灵敏度进行归一化处理。可通过基因体外转录技术获得在DNA芯片中作为内标的poly(A)+RNA。
6、tRNA结构与功能研究
tRNA是蛋白质生物合成的关键元件之一。研究tRNA的结构与功能需要足量的tRNA分子作为研究材料。应用基因体外转录技术,可以快速、大量获得tRNA,为相关研究提供足够的材料。
7、检测转录水平的方法学改进
应用RY-PCR检测体外转录后反应体系中RNA含量的方法,具有灵敏度高、操作简便、无需同位素等优点。该方法的另一优点是被研究的基因启动区下游可以是原有的编码基因,也可以是任何一种已知的编码基因片段,而不必次级克隆特定的序列,这样可以简化模板的制备步骤。该技术若与其他技术结合,如印迹分析技术,则可获得更高的灵敏度。
综上所述,通过体外转录,除了研究基因表达的调控外,还可以直接获得RNA病毒、siRNA、核酶、tRNA及其他功能性RNA,还可以获得用于脱氧核酶剪切的底物mRNA,为RNA结构和功能的进一步研究提供了一个操作简便、可靠的技术平台。
五、反向遗传学技术在疾病研究中的发展前景分析
1、利用反向遗传学技术高效性的研制病毒疫苗。
2、利用反向遗传学技术可以创造出对人类有益的新型病毒。
3、利用反向遗传学技术进行疾病以及疾病的治疗方法研究。
六、展望
作为新兴的学科,反向遗传学的研究正处于快速的起步阶段,随着正向遗传学和反向遗传学的结合,它们将会为遗传学及其相关的生物化学、分子细胞和发育生物学等领域的未来发展指明方向,更好的为人类了解生命的本质贡献力量。因此,反向遗传学技术具有广泛的研究与应用前景。
参考资料
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2、张英等,反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用,动物医学进展,2008,29(3):3.60~63
3、杨宇等,反向遗传学在现代生物学领域中的应用,生物技术通报,2009,(5):43~45
4、朱剑平,基因沉默技术的研究进展及应用,养生保健指南,2018,(3):229
5、谢开飞等,既然有感染者病例,科学家们为何还要构建活的新冠病毒?科技日报,2020-06-06
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