信使RNA疗法
发布时间:2020-11-30 08:42:21 | 来源:【药物研发团队 2020-11-30】
信使RNA(mRNA)是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
以细胞中基因为模板,依据碱基互补配对原则转录生成mRNA后,mRNA就含有与DNA分子中某些功能片段相对应的碱基序列,作为蛋白质生物合成的直接模板。mRNA虽然只占细胞总RNA的2%~5%,但种类最多,并且代谢十分活跃,是半衰期最短的一种RNA,合成后数分钟至数小时即被分解。
mRNA能将DNA携带的遗传信息翻译成实现细胞功能所需的蛋白质,在蛋白质的表达中具有重要作用。当DNA发生突变时,转录得到的mRNA异常,进而不能产生蛋白质或产生具有缺陷的蛋白质。
mRNA是生命的核心分子之一。在过去的30多年里,科学家们逐渐对这种分子的潜在医用价值产生了浓厚兴趣,想利用其指导蛋白合成的特殊能力,开发出全新的医学平台。
在细胞里,mRNA能将基因里的遗传信息传递给蛋白质合成工厂,指导蛋白质的合成。或许是因为人们对“根源”或“结果”的看重,在新药研发领域,无论是mRNA上游的DNA,还是下游的蛋白质,都得到了充分的研发:针对DNA突变的基因疗法方兴未艾,针对蛋白的靶向疗法更是主流。而mRNA被夹在其中,很少有人探索,处境尴尬。
这并非是由于mRNA本身没有潜力。事实上,早在1990年,宾夕法尼亚大学的Katalin Karikó教授就提出,在基因疗法领域,mRNA疗法也许可以成为DNA疗法的替代。两者的长处一目了然,DNA疗法的作用即便不是永久,也是长效的,而mRNA能提供短期内的修正。对于由于基因突变导致的遗传病来说,DNA疗法也许更为适合。而在其他疾病领域,mRNA有一展拳脚的空间。
“但(当时)没有人对它感兴趣。” Karikó教授回忆道。mRNA不是一种容易操作的分子,它不如DNA和蛋白质稳定,很容易被降解。但更重要的是,即便mRNA能被稳定提取并注射到动物体内,它也会引起一系列免疫反应,就像是身体在对抗病毒入侵一般。因此,它在安全性上有巨大隐患,这基本宣判了这种治疗思路的死刑。
但Karikó教授迎难而上。2005年,她与同事Drew Weissman教授一道做出了一个突破性的发现—mRNA之所以能引起免疫反应,其关键在于一种叫做尿嘧啶的核苷酸。如果将其核苷部分进行简单的修饰,产生“假尿嘧啶”,就能逃脱免疫系统的监控。mRNA疗法的大幕,由此正式拉开。
mRNA 是由 DNA 作为模板转录而来,携带有遗传信息并指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。将 RNA 作为一种药物,理论上具有诸多传统药物不具备的优势:比如,mRNA 翻译快速,起效更快,并且本身也有激活免疫反应的作用;同时,mRNA 药物生产简单、易于改造、合成快速、成本较低;更重要的是,mRNA 药物不局限于分裂细胞,没有整合宿主基因组的风险,且会在体内自动降解。
在新药研发领域,针对目标蛋白的靶向疗法已经成为主流,针对 DNA 突变的基因疗法也正如火如荼,而作为基因和蛋白质之间桥梁的 mRNA,近年来正越来越受关注。
mRNA与人体蛋白质的合成息息相关,对遗传信息的表达有着不可替代的作用。基于mRNA的独特功能,一直以来,科学研究人员都希望通过人工合成的mRNA或者阻断会产生致病蛋白的mRNA来为人类治疗某些疾病。
上个世纪90年代,科学家们开始用体外合成的mRNA进行了对多种疾病临床前治疗研究,包括蛋白质替换治疗或者通过疫苗的形式来治疗癌症以及多种感染疾病。
2017年,Moderna公司发布了第一个mRNA药物的人体临床I期试验数据。本次人体试验的药物是针对禽流感病毒H10N8的感染性疾病疫苗mRNA-1440,研究结果表明,mRNA-1440在人体内诱导了高水平的免疫原性,并且是安全的,耐受性良好的。这个里程碑事件为mRNA治疗人类疾病开启了想象的空间。此外,该公司还有多个mRNA疗法在管线,涉及感染性疾病、肿瘤、罕见病、心血管疾病的疫苗和治疗药物。
想象一下,可能在不久的将来,我们可以指导我们的身体自己制造他们所需要的药物,这是一种多么令人振奋的技术。使这成为可能的技术被称为mRNA(mRNA)疗法,它可能成为治疗多种疾病的主要工具。 目前,mRNA疗法的研发已取得突破性进展,作为一种颠覆性技术,mRNA疗法可能开创人类与疾病斗争的新纪元,我们必须予以高度关注。
一、mRNA
mRNA是指导蛋白质生物合成的直接模板。mRNA 占细胞内RNA总量的2%~ 5%,种类繁多,其分子大小差别非常大。[2]
信使RNA(mRNA)是一大类RNA分子,它将遗传信息从DNA传递到核糖体,在那里作为蛋白质合成模板并决定基因表达蛋白产物肽链的氨基酸序列。 RNA聚合酶将初级转录物mRNA(称为前mRNA)转录成加工过的成熟mRNA,这种成熟的mRNA被翻译成蛋白质。
如同在DNA中一样,mRNA遗传信息也保存在核苷酸序列中,其被排列成由每个三个碱基对组成的密码子。每个密码子编码特定氨基酸,但终止密码子例外,因为其终止蛋白质合成。
将密码子翻译成氨基酸的过程需要另外两种类型的RNA:转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。tRNA介导密码子的识别并提供相应的氨基酸,rRNA是核糖体蛋白质制造机械的核心组成部分。
mRNA的存在首先由Jacques Monod和FrançoisJacob提出,随后由Jacob,Sydney Brenner和Matthew Meselson于1961年在加州理工学院发现。
(一)原核生物和真核生物mRNA有不同的特点
原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。[3]
原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的,真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工,加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。
原核生物mRNA半寿期很短,一般为几分钟 ,最长只有数小时(RNA噬菌体中的RNA除外)。真核生物mRNA的半衰期较长, 如胚胎中的mRNA可达数日。
原核与真核生物mRNA的结构特点也不同。真核生物mRNA具有5‘帽子和3’多聚A尾巴,原核生物没有这样的首尾结构。
(二)单顺反子与多顺反子mRNA
翻译产物仅是单个蛋白质链(多肽)的mRNA称为单顺反子mRNA。大多数真核mRNA都属于单顺反子mRNA。多顺反子mRNA携带几个开放阅读框(ORF),每个开放阅读框都能被翻译成一条多肽,这些多肽通常具有相似的功能,通常构成最终复合蛋白的不同亚基。这些多肽链对应的DNA片断则位于同一转录单位内,享用同一对起点和终点。细菌和古细菌中的大多数mRNA是多顺反子的。
(三)mRNA的环化
在真核生物中,由于eIF4E和poly(A)结合蛋白之间的相互作用,mRNA分子形成环状结构,这两种结合蛋白都与eIF4G结合,形成mRNA-蛋白-mRNA桥。环化促进核糖体在mRNA上的循环,提高翻译效率,且确保仅有完整的mRNA得到翻译。
二、mRNA的合成和加工
mRNA分子的合成始于转录,并最终以降解结束。在被翻译之前,真核mRNA分子通常需要大量加工和转运,而原核mRNA分子则不需要。真核mRNA分子和它周围的蛋白质一起被称为信使RNP。
(一)转录
转录是指由DNA合成RNA的过程。在转录期间,RNA聚合酶根据需要将一个基因的DNA拷贝成mRNA,这个过程在真核生物和原核生物中是相似的。
与原核生物明显不同的是,真核RNA聚合酶在转录过程中与mRNA加工酶结合,因此,真核生物的mRNA加工可以在转录开始后快速进行。短寿命的未加工或部分加工的转录产品称为前体mRNA或pre-mRNA;一旦加工完全,它被称为成熟mRNA。
(二)真核pre-mRNA加工
mRNA的加工在真核生物、细菌和古细菌中差异很大。实质上,非真核mRNA在转录时是成熟的,除极少数情况外不需要加工。然而,真核pre-mRNA需要大量加工。
1、加帽
即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内,即对HnRNA进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下,将5'-端的磷酸基水解,然后再加上鸟苷三磷酸,形成GpppN的结构,再对G进行甲基化。
5‘ 帽(也称为RNA帽,RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)就是一个经修饰的鸟嘌呤核苷酸,在转录开始不久后就被添加到新产生的真核mRNA的“前”即5'末端。 5’帽由末端7-甲基鸟苷残基组成,它通过5'-5'-三磷酸键与第一转录出的核苷酸连接。它的存在对于核糖体的识别和对mRNA的保护至关重要。
2、加尾
mRNA加尾这一过程也是细胞核内完成,首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸,然后再加入polyA。
3’端加尾是指聚腺苷酰基部分与mRNA分子的共价连接。在真核生物中,大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被多聚腺苷酸化。Poly A尾巴和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被核酸外切酶降解。3’端加尾对于转录终止,从细胞核输出mRNA和翻译也很重要。 原核生物中的mRNA也常被3’端加尾,但此时的poly(A)尾巴促进而不是防止核酸外切酶对mRNA的降解。
3、剪接
真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子,而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA参与构成的核蛋白体参加,通过形成套索状结构而将内含子切除掉。
4、内部甲基化
mRNA的内部甲基化由甲基化酶催化,对某些碱基进行甲基化处理。
(三)mRNA的转运
真核生物和原核生物之间的另一个区别是mRNA的转运。由于真核转录和翻译是在不同的细胞器内进行的,真核mRNA必须从细胞核输出到细胞质。 这一过程可能受不同信号通路的调节。成熟的mRNA通过其加工的修饰被识别,在结合帽结合蛋白CBP20和CBP80及转录/输出复合物(TREX)后通过核孔被输出到细胞质。
(四)mRNA的翻译
因为原核mRNA不需要加工或转运,所以原核生物mRNA在核糖体的翻译可以在转录结束后立即开始。因此,可以说原核生物的mRNA翻译与转录偶联发生。
已经加工并转运至细胞质的真核mRNA(即成熟mRNA)在核糖体的翻译发生在细胞质中自由漂浮的核糖体中,或者通过信号识别颗粒导向到的内质网中。因此,与原核生物不同,真核生物的mRNA翻译不直接与转录偶联。在某些情况下甚至可能发生这样的情况,即mRNA水平的降低却伴随着蛋白质水平的增加。
(五)mRNA的降解
同一细胞内的不同mRNA具有不同的寿命(稳定性)。在细菌细胞中,单个mRNA可以存活数秒至超过一小时,但平均寿命为1至3分钟,因此,细菌mRNA的稳定性远低于真核mRNA。哺乳动物细胞mRNA的寿命从几分钟到几天不等。mRNA的稳定性越高,从该mRNA产生的蛋白质越多。 mRNA的有限寿命使细胞能够快速改变蛋白质合成以响应其不断变化的需求。有许多机制可导致mRNA的降解。
1、原核mRNA的降解
原核生物mRNA的降解是不同核糖核酸酶包括核酸内切酶,3'核酸外切酶和5'核酸外切酶的共同作用的结果。在一些情况下,长度为数十至数百个核苷酸的小RNA分子(sRNA)可通过与互补序列碱基配对来促进RNase III对特定mRNA的降解。
2、真核mRNA的降解
真核细胞的翻译和mRNA衰变之间存在着平衡。正在被翻译的mRNA被核糖体,真核起始因子eIF-4E和eIF-4G以及poly(A)结合蛋白结合,不能接触外泌体复合物,mRNA得到保护。mRNA的poly(A)尾巴被特异性外切核酸酶缩短,该核酸外切酶通过RNA上的顺式调节序列和反式作用RNA结合蛋白的组合定位到特定mRNA。 Poly(A)尾巴被去除破坏了mRNA的环状循环结构并降低了帽结合复合体的稳定性,导致mRNA会被外来体复合物或脱帽复合物降解。通过这种方式,可以快速降解翻译不活跃的mRNA,而翻译活跃的mRNA不受影响。
3、小干扰RNA
在后生生物中,由Dicer酶产生的小干扰RNA(siRNA)被整合到称为RNA诱导沉默复合物(RISC)。该复合物含有内切核酸酶,切割与siRNA结合的完全互补的mRNA,产生的片段然后被核酸外切酶降解。 siRNA通常用于实验室细胞培养中阻断基因的功能。siRNA被认为是病毒先天免疫系统的一部分,可以用于对双链RNA病毒的防御。
4、微小RNA
微小RNA(miRNA)是小RNA,通常与后生生物mRNA中的序列部分互补。 miRNA与mRNA的结合可以抑制该mRNA的翻译并加速poly(A)尾部去除,从而加速mRNA降解。
(六)mRNA的提取、分离和纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20~30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA。
三、mRNA修饰
携带遗传信息的mRNA分子在细胞中发挥着基础而又不可或缺的作用,凭借无毒性能在所有细胞类型表达瞬时蛋白,并在基因转移和特定分子表达上比DNA分子更具优势。此外,已知序列的蛋白质能被重写编码和表达,这使得 mRNA 在合成和应用过程中具有更大的灵活性。
然而,科研人员在 mRNA 提取中都会遇到繁琐的过程,其中最为重要的是保持mRNA的稳定性以供后续分析,而对mRNA 构成威胁的是人体分泌的RNA 酶,它存在于眼泪、唾液、黏液和汗水等体液中负责降解单链 RNA 以防御那些入侵的微生物。
曾经,普遍接受的观念是不太稳定的、很难操作的 mRNA 不能有效地应用于医疗,然而,科研人员攻克这一难题后,使mRNA在体内表达药用蛋白成为可行。如今,mRNA分子成为研究对象的领域涉及到,新的医疗手段(如肿瘤疫苗)、预防性疫苗(针对感染性疾病)以及基因和蛋白疗法的替代治疗等。
经化学修饰的 mRNA 能逃避人体的先天性免疫应答,成为一种多用途的、无毒性分子,能用于许多人类疾病的治疗。研究人员已克服了mRNA 的利用难题,这将见证高效的、低成本的 mRNA 治疗时代的来临。
mRNA的核苷酸修饰主要包括2'--O—甲基化、假尿嘧啶化、m6A、m5C、m7G、m1A、 5hmC等。已有的研究表明,这些修饰在mRNA的稳定性、加工、遗传信息传递以及细胞的应激反应中起到重要的作用。
过去几十年,由于技术的限制,使得mRNA修饰的研究进展较为缓慢。近几年来出现的新技术手段为研究mRNA的修饰提供了很大的便利。虽然ψ-seq 和RiboMeth-seq等技术对假尿嘧啶化修饰和2'—O—核糖甲基化修饰位点的定位可以达到单核苷的精度,但是基于免疫沉淀技术的MeRIP和m6A-seq手段对m6A位点的定位精度还不够高。
SCARLET技术虽是单核苷酸精度,但是无法高通量,不过miCLIP和PA-m6A-seq技术已经
能做到单核苷酸分辨率。此外,还有很多RNA修饰缺乏相应的技术手段去深入研究。因此,在技术方面还需要有更多的"NGS+"型(传统检测手段与高通量测序相结合)的高通量技术产生。随着新技术的产生,不仅可以促进修饰的功能研究,也有可能像发现mRNA假尿嘧啶化修饰那样,在mRNA上发现新的修饰。
以往的研究多集中在修饰的鉴定和修饰位点的确定,近来一些关于修饰生成机制及其生物学功能研究已经表明,mRNA上的修饰具有重要的生物学功能,并且有些修饰高度动态可变。随着表观转录组学的发展和新技术的不断涌现,将极大地促进mRNA转录后修饰形成机制和生物学功能的研究。我们将逐步揭开mRNA转录后修饰在复杂的功能调控网络中的重要作用。不同物种中的mRNA转录后修饰研究将揭示这些修饰在进化的过程中是何时产生以及它们是怎样保持和演变的,这对我们深入理解mRNA转录后修饰的重要生物学功能具有重要意义。mRNA的转录后修饰研究不仅会推动表观转录组学的发展,同时也将促进个体化医疗和精准医疗的发展。
四、mRNA疗法的应用
(一)理论上的蛋白替代
弗朗西斯·克里克在1958年提出分子生物学领域著名的“中心法则”,沿着“中心法则”遗传信息从DNA传递给mRNA,再通过mRNA传递给蛋白质。在这个过程中,mRNA是遗传物质从DNA传递到蛋白质的中间载体。同时,在遗传信息流动的方向,不同的层面对应着不同的医药技术。DNA对应的是基因层面上的基因治疗,mRNA对应的是在转录层面上对疾病进行的mRNA药物干预,蛋白质对应的是在遗传信息流动的终端—蛋白质层面对疾病的干预,这包括多肽药物、抗体药物、蛋白类药物;由于mRNA处于蛋白质的“上游”,因此从理论上讲,mRNA可以对所有蛋白层面的药物进行替代。
(二)mRNA预防性疫苗
将编辑病原蛋白的mRNA药物注射到人体,可以作为相应病原的预防性疫苗。尤其对于病毒,由于mRNA在细胞内部表达蛋白质,因此可以很好的模拟病毒感染的自然状态;另外,多个表达不同蛋白的mRNA可以被设计在同一个制剂中,相比于传统疫苗,mRNA疫苗更容易开发为“多价”产品;相较于传统疫苗,mRNA疫苗的研发周期较短,以Moderna公司的的新冠肺炎疫苗为例,该产品从立项到进行I期临床试验仅仅用了42天,远远缩短了疫苗的研发时间。
(三)mRNA癌症疫苗
通过mRNA编辑肿瘤抗原,激发人体的抗肿瘤免疫反应,该类药物称为mRNA肿瘤疫苗。如果编辑的抗原为肿瘤通用型抗原,则为通用型mRNA肿瘤疫苗,如果编辑的抗原为患者个性化抗原,则为个性化mRNA肿瘤疫苗。Moderna在该领域有两个产品管线,一个是个性化的肿瘤新抗原疫苗(mRNA-4157),另一个是靶向通用抗原KRAS的肿瘤疫苗(mRNA-5671)。mRNA-4157产品中包含了多达34种肿瘤抗原,mRNA-5671中包含了4种KRAS突变蛋白,多位点蛋白的设计增强了诱导T细胞抗肿瘤反应的概率;mRNA疫苗还可以在细胞内部表达蛋白质,省去了抗原摄取的步骤可能有利于免疫系统的激活;mRNA肿瘤疫苗非常容易实现个性化治疗,Moderna可以在60天内实现个性化肿瘤疫苗从设计到临床使用。
(四)mRNA瘤内免疫干预药物
通过瘤内注射表达特定抗原或者细胞因子的mRNA,对肿瘤微环境进行干预,激活肿瘤组织内的免疫反应,起到对肿瘤的杀伤作用。Moderna在该领域设置了3条产品管线,OX40L(mRNA-2416),OX40L为细胞膜蛋白,可以和T细胞表面的OX40L蛋白结合,进而激活T细胞,诱导T细胞的肿瘤杀伤作用,目前该管线正在美国进行I/II期的临床试验。第二条管线为OX40L/IL-23/IL-36γ(mRNA-2752),该产品同时表达三种蛋白,从T细胞共刺激分子和促炎因子两个方面着手用于改善肿瘤微环境,目前该产品已经在晚期实体瘤患者体内进行I期临床试验。第三条管线为IL-12(MEDI1191),为阿斯利康联合开发产品,阿斯利康主导该品开展了单一和联合治疗的I期临床试验。
CureVac也在该领域布局多款产品:其中BNT151和BNT153编码细胞因子均为IL-2,BNT152编码的细胞因子为IL-7。
(五)局部再生治疗mRNA药物
通过局部给与mRNA表达特定功能蛋白,起到弥补缺失蛋白的作用。Moderna在和阿斯利康联合开发的一款产品AZD8601,表达EGFR-A蛋白,适应症为心肌缺血,通过前臂皮下给药。该产品已经由阿斯利康主导完成了临床I/II期试验,药物的安全性以及药效(蛋白表达量和对血流的影响)都达到了预期终点。
(六)系统再生治疗—非胞内蛋白
通过mRNA对细胞分泌型和细胞表面蛋白的再生来实现疾病缓解和治疗。Moderna在该领域布局了4款产品,包括:基孔肯雅病毒抗体(mRNA-1944)、用于治疗心力衰竭的松弛素(ZAD7970)、自身免疫疾病领域的IL-2(mRNA-6231)以及用于自身免疫性肝炎治疗的PD-L1(mRNA-6981)。目前,mRNA-1944项目在进行健康志愿者I期临床试验,其它产品还处在临床前研发阶段。
(七)系统再生治疗—细胞内蛋白
通过mRNA对细胞内的酶或者细胞器特异的蛋白再生来实现疾病的缓解和治疗。Moderna在该领域布局了4款产品,包括:适应症为甲基丙二酸血症的mRNA-3704、适应症为丙酸血症的mRNA-3927、适应症为苯丙酮尿症的mRNA-3283和适应症为1a型糖原储存障碍症的mRNA-3745。mRNA-3704已经获得了FDA和欧盟的孤儿药认证,并已经开展I/II期临床试验。mRNA-3927也获得了FDA和欧盟的孤儿药认证并获得FDA的优先审评资格,正准备开展I期临床试验。其它两款产品正处在临床前研发阶段。
(八)mRNA抗体药物
BioNtech设计了Ribomab系列产品。设计的目的是希望进入体内的mRNA能在体内表达特异抗体,起到治疗作用。BNT141是该系列的第一款产品,适应症为实体瘤,可以在体内编码分泌型的IgG抗体,预计在2021年进入临床试验;BNT142是该系列的第二款产品,适应症也为实体瘤,设计编码双特异性抗体,靶点为CD3和CLDN6,预计在2021年进入临床试验。
(九)mRNA疫苗
上世纪 90 年代,科学家首次尝试将体外转录的 mRNA 注射到小鼠体内,结果检测发现其可在小鼠体内表达活性,并产生相关蛋白。这种直接注射 mRNA 的方法能够通过表达特定蛋白,产生免疫反应,成为了 mRNA 疫苗的雏形。
mRNA 疫苗的工作原理可以理解为携带细胞制造抗原蛋白指令的 mRNA,进入人体后被细胞吞噬,细胞内的蛋白质制造工厂便根据指令,将抗原蛋白制造出来,从而激活免疫系统,引起特异性的免疫反应。
与传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗相比,mRNA 疫苗制备步骤简单。比如,当一种新型流感病毒开始传播的时候,在没有疫苗库存的情况下,通过鸡胚培养批量生产流感疫苗需要九周的时间,而生产 mRNA 疫苗仅需要一周。这对于传染性疾病的控制有着重大意义。此外,mRNA 疫苗比传统重组疫苗更耐高温也更加稳定。“传统疫苗需要冷链运输也需要在冰箱保存,如果运输或者保存不当,都容易造成疫苗失效,而 mRNA 疫苗可以在 40 摄氏度下有效保存一年不失效,在 70 摄氏度下能有效保存三个月。
虽然动物实验表明mRNA 可以发挥类似疫苗的作用,从而达到治疗传染病和癌症的目的,但由于 mRNA 易在体内降解且缺乏有效的递送载体,因此,从上世纪 90 年以来,核酸药物递送体系的开发,就一直是技术突破的关键。
五、mRNA疗法研发现状
从上个世纪九十年代出现的以鱼精蛋白、阳离子高分子 PEI、阳离子脂质体为代表的第 1 代 RNA 递送系统,到九十年代末以可降解可离子化高分子为代表的第 2 代递送系统,再到近些年出现的第 3 代可离子化脂质纳米粒载体,RNA 药物递送载体技术的进步,极大地促进了 RNA 制药产业的蓬勃发展。
目前,全球 mRNA 制药领域已经形成非常年轻却都充满传奇色彩的三巨头:一是成立于 2010 年的Moderna Therapeutics公司;二是欧洲最大生物技术独角兽BioNTech公司;三是mRNA 制药行业的领军企业 CureVac公司。作为生物体自身的重要生物分子,将mRNA 作为药物有其独特的先进性,近十年来载体技术的飞速发展,已经使得mRNA药物成为现实。目前,mRNA制药三巨头的研究领域主要集中于感染性疾病和肿瘤疫苗上。
作为mRNA药物的核心技术与门槛之一,最先进的RNA制剂和递送技术的较量,一直是这些新兴RNA制药巨头研发领域的重中之重。其中,Moderna公司采用的是可以较好维持RNA稳定性的脂质体纳米粒(LNP)递送技术;BioNTech公司采用的是脂质体运载Lipoplexes(LPX)技术;而 CureVac公司最初使用的是鱼精蛋白制剂技术,不过由于该技术对 RNA 的保护较弱,因此,CureVac通过与Acuitas Therapeutics公司合作也获得了 LNP技术。
Robert Langer 和 Daniel Anderson 从上个世纪九十年代末,已经开始主攻 RNA 药物递送领域,并曾开发了聚 beta 氨基酯递送系统。在最新的一项研究中,Daniel Anderson、Robert Langer 和李林鲜等人开发的新型 mRNA 疫苗递送系统,可以认为是第 3.5 代 RNA 药物递送系统。因为之前第 3 代系统主要侧重于不同组织和细胞的蛋白表达量和载体毒性,而这项研究的递送系统不单是提高蛋白的表达量,还能够促进干扰素刺激基因(STING)信号通路介导的免疫细胞活化。
STING 被认为是先天免疫和适应性免疫的中心调节因子。当受到刺激时,STING 会诱导 I 型干扰素、细胞因子和 T 细胞募集因子的表达,从而导致巨噬细胞、树突状细胞、天然效应细胞(如NK)以及肿瘤特异性T细胞的激活。
mRNA疫苗在体内表达抗原的同时还能激活STING信号通路,显著增强了肿瘤抗原特异性免疫反应。在肿瘤动物模型上,也观察到了更好的肿瘤抑制效果。这也意味着,mRNA疫苗可与其它癌症治疗方法,如检查点抑制剂和免疫激动剂相结合,以获得更全面的癌症治疗效果。
作为基于mRNA药物开发技术的领导者CureVac公司,一直致力于使用以mRNA为载体指导人体产生治疗疾病的蛋白质。2017年与礼来合作研发抗癌疫苗。在与礼来的合作中,CureVac将使用其RNActive技术,负责mRNA的设计、配方、以及临床试验用药品的生产。这些mRNA编码了肿瘤特异的新抗原。按设想,这些mRNA进入人体并翻译成蛋白后,能在人体内诱发免疫反应,从而使人体免疫系统对癌细胞进行选择性杀伤,以消灭癌症。
2018年,一项由瑞士制药巨头诺华和北卡罗来纳大学进行的研究显示:当涉及到可成药的药物结构时,mRNA具有巨大潜力。诺华/北卡罗来纳大学一篇刊登在《Chemical & Engineering News》上的报道表明,mRNA的结构远比以前想象的更具功能性,尤其是在用于疾病治疗开发领域。该报道称,诺华、阿斯利康、辉瑞等公司都热衷于挖掘阻断会产生致病蛋白的mRNAs的潜力。使用基于mRNA的药物去治疗某些疾病已显示出希望,多家公司正在将这一领域视为一种潜在的疾病治疗方法。
有了这一研究基础,诺华和其他药物开发人员将开始研究RNA在体内的调节作用,以及如何将其用于治疗疾病。诺华公司的生物学家Razvan Nutiu称,他的团队将研究RNA结构如何影响机体功能,以及这种功能如何与疾病联系在一起。诺华已经开始致力于靶向RNA作为肿瘤治疗的一种潜在方法的研发,此外,该公司还在探索mRNA在心血管、肌肉骨骼和神经系统研究方面的潜力。
(一)肿瘤免疫治疗和预防性疫苗
理想的肿瘤疫苗应可激活先天性和适应性免疫系统,以诱导广泛有效的持久免疫应答(体液免疫和T细胞介导的应答),而编码肿瘤相关抗原的mRNA分子提供一条体内合成抗原的最佳途径,从而对肿瘤患者进行直接性的接种免疫。
众所周知,人体免疫系统将细菌DNA和病毒RNA视为外源核酸,这些核酸通过活化Toll样受体可激活哺乳动物的固有免疫系统即非特异性免疫系统。双联 RNA作为常见的病毒中间体可激活TLR3,而单链RNA和病毒性 RNA 激活人体TLR7和TLR8 。
十多年前的一项研究表明,直接注射裸露的、未受保护的 mRNA能引起细胞毒T淋巴细胞和抗体的免疫应答,这反映出 mRNA在肿瘤免疫治疗领域提供了有吸引力的多肽和DNA的替代疫苗,该研究为以后的首个基于 mRNA的免疫治疗铺平了道路。
但是,用裸露的RNA进行接种免疫在临床上是不可行的,其不能有效地诱导抗原递呈细胞的成熟,而那些结合阳离子肽和硫代磷酸酯骨架的mRNA能抵御 RNA酶分解,并成为功能强大的免疫激活分子。此外,两种成分的RNA 分子(游离的和精蛋白结合的)组成了mRNA络合物,能诱导适应性免疫应答并提供体液和T细胞介导的微环境。 mRNA 络合物支持了抗原表达和 TLR7 介导的免疫刺激(完全独立于 HLA),从而弥补了多肽和蛋白疫苗的缺失特性。
早期临床试验表明,前列腺癌和肺癌患者接受mRNA疫苗治疗后表现出令人信服的安全性,值得注意的是, mRNA疫苗不需要任何的转运载体而从皮内注射。早期的数据表明,基于 mRNA的特异性免疫疗法在两个试验中都达到了预定的目标:T细胞的特异性抗原在多数患者中被检测出;B细胞非特异性抗原的频度在多数患者中提高了。
(二)mRNA疫苗在传染性疾病的应用
mRNA疫苗在传染性疾病的应用还处于研究之中。2012年,德国研制出一次接种终生有效的mRNA流感疫苗,结果发表在《自然•生物技术》杂志上。研究表明,当mRNA 被注入人体时,它会被人体免疫细胞检测到,然后将其翻译成蛋白质。研究人员解释说,这些疫苗蛋白质会被人体认为异物而对其进行免疫应答。 mRNA不被降解,这种应答反应就持续存在。此后一旦身体再遇到该种病毒时,就会促发人体快速免疫反应,从而将病毒扼杀在初期。
当前,全球都在等待新冠肺炎疫苗。而最值得期待的是一种基于mRNA技术的疫苗,正在美国FDA的绿色通道审批中。相比传统疫苗,它更安全、快速、副作用小。
2019年底,新冠病毒肺炎疫情爆发。2020年1月10日,中国科学家发布了新冠病毒基因序列。由于mRNA技术不需要病毒本身来制造疫苗,Moderna、BioNTech和其他公司的研究人员便开始工作,试图用这一技术快速制造出新冠肺炎疫苗。
BioNTech与辉瑞达成合作,投入了数十亿美元开展新冠病毒mRNA疫苗研发。
目前,全球有十多种疫苗在后期临床试验阶段,但只有辉瑞和Moderna的为mRNA疫苗。疫苗的原理都一样,教人类的免疫系统起反应,来抗击外来病毒。
传统疫苗,将灭活或者减活病毒,注射入人体。这需要很长时间培育和优化病毒,而且,注射进人体的病毒,可能给人带来风险。
mRNA疫苗,并不需要真正的病毒注射到人体,而是人造了一个RNA片段,诱发人体产生同样的免疫反应,从而达到抗体的作用。
与传统疫苗比较,mRNA疫苗具有以下优势:一是安全、副作用小。mRNA疫苗并没有真正的病毒注射到人体,只是激发了人体免疫反应,因此,人不可能因为注射病毒而感染病毒,副作用要小很多;二是有效性强。一般的流感疫苗,只有超过50%的有效性。此前,医学界预计mRNA疫苗有效性在60%~70%。但两家公司研发的新冠病毒mRNA疫苗大规模试验接种结果显示,有效率超过95%;三是mRNA疫苗研发生产速度快。常规疫苗的制造,从病毒分离、提纯、培育等过程需要几个月,而mRNA疫苗不需要这些步骤,只需几周时间,大大缩短了研发周期,大大提高了研发效率。
但mRNA疫苗也存在储存和分发问题。辉瑞的新冠病毒mRNA疫苗需要存储在极冷的环境中,在美国已建立了多个巨大的新冠病毒mRNA疫苗储存中心。在运输过程中,新冠病毒mRNA疫苗全程都需要隔温箱加干冰运输,但只要运到了医院,就能在普通的冰箱中保存5天。新冠病毒mRNA疫苗的分发,将是有史以来规模最大的。仅辉瑞公司,就计划每24小时20架飞机,在美国境内运送疫苗。
Moderna的新冠病毒mRNA疫苗的保存条件没有这么苛刻,但也需要全程冷藏,而且,其生产能力没有辉瑞那么强大。
所以,新冠病毒mRNA疫苗目前只能提供给美国等发达国家,可以说是富人的专利。广大的发展中国家和农村地区,可能还得依赖传统的疫苗,或者等待这种疫苗生产能力的提升。
(三)mRNA的其他医疗用途
mRNA在体内用作基因治疗的主要限制是,其能引起先天性免疫应答。Katalin Karikói博士及其同事研究发现,树突状细胞和表达TLR的细胞被高效激活的对象是细胞和病毒RNA(富含修饰过的核酸),而不是哺乳动物的RNA ,这表明先天性免疫系统识别那些缺少修饰的核酸。此外,修饰核酸掺入后能降低先天性免疫应答并提高mRNA的表达,而去除双链 RNA也可避免对I型干扰素(干扰素)和促炎细胞因子的诱导。
六、mRNA疫苗研究进展
相对于DNA疫菌,mRNA疫苗是一种比较安全的新型核酸疫苗。mRNA疫苗的分子设计及化学修饰的研究目前集中于整强其稳定性和降低其免疫原性。mRNA疫苗的递送主要包括脂质体、非脂质体、病毒、纳米颗粒等。新的递送方法也在不断产生。mRNA疫苗用于肿瘤、感染性疾病等的防治研究表明其具有良好的效果,有较好的应用前景。
近年来,mRNA疫苗技术发展非常迅速,且仍有宽广的发展空间。新的mRNA疫苗的设计、mRNA递送技术的发展均可以影响到靶蛋白的表达及mRNA与模式识别受体的相互作用。直接将mRNA递送至细胞质,可以增强靶蛋白的表达,避免与模式识别受体的结合,也可大大减弱mRNA递送本身带来的免疫刺激。新的方法来增强mRNA靶向特异性的细胞类型也成为mRNA疫苗潜在的突破方向。在mRNA递送过程中包含一些附属的mRNA分子也可能成为获得更好免疫效果的突破方向。但是,这些可能的突破方向都会增加mRNA疫苗生产及处理方法的复杂性。而传统的免疫佐剂均能抑制mRNA疫苗蛋白的表达。从mRNA本身的特性、引发的免疫反应情况、大规模疫苗生产的有利条件等方面来看,mRNA疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势。迄今,mRNA用于治疗的目的,还限制在癌症的免疫治疗中通过将mRNA转入树突状细胞方面。目前,mRNA疫苗的研究主要聚焦于增强mRNA的稳定性、降低其免疫原性和发展新的递送技术,而将mRNA疫苗应用于不同类型疾病的防治研究也在不断的拓展。可以预计,新的高效、稳定的mRNA递送技术将成为mRNA疫苗应用于临床的关键。总之,mRNA疫苗的研究将在肿瘤及感染性疾病等的防治领域发展迅猛,并发挥重要作用。
七、mRNA疗法在肿瘤免疫治疗中的研究进展
mRNA疗法以mRNA为制剂治疗疾病,是一种新兴的基因疗法,既可通过功能性蛋白的表达治疗基因缺陷性疾病或组织修复,又可通过抗原或抗体或受体的表达应用于免疫治疗,具有极大的应用价值。在肿瘤免疫治疗中,编码肿瘤相关抗原、抗体或受体的mRNA进入细胞质后翻译成蛋白质,进而诱导特定免疫反应,实现疾病的预防与治疗。随着免疫治疗技术和mRNA的技术发展,针对恶性肿瘤和传染性疾病等的mRNA免疫治疗已步入临床应用阶段。
近年来,随着mRNA技术的发展,RNA疗法越来越广泛地应用于临床研究。早期的mRNA疗法主要专注于传染性疾病治疗,最近越来越多的研究将mRNA疗法应用于肿瘤免疫治疗并取得了积极的疗效。体外电脉冲导入mRNA的树突状细胞(DC)疫苗有着良好的发展前景,但在制备和扩增方面存在诸多局限。目前正在研究替代细胞,如B淋巴细胞就是一种颇具潜力的抗原提呈细胞(APC),较DC有更强增殖能力,且能增加淋巴细胞器官靶向性。另一个策略是使用更易制造的模拟天然APC功能的合成APC。同时,DC疫苗特异性抗原及TCR-T、CAR-T治疗靶点的筛选也是一个巨大的挑战,此外需设计构造出生物兼容性新型智能生物递送策略,以实现多个甚至十几个抗原同时原位递送至APC,引发多种多样的特异性T细胞,发挥肿瘤杀伤作用。虽然mRNA疗法作为发展中的技术,仍有很多问题亟待解决,如需提高其本身在体内外的稳定性,实现大规模生产成本的合理化,提高原位转导效率等,但mRNA在肿瘤免疫治疗领域的应用已经显现良好的前景,其商业化指日可待。
八、m6A修饰在人类相关致病病毒中的作用研究进展
m6A(N6-腺苷酸甲基化)修饰是真核生物中最为常见的mRNA转录后修饰方式,主要受甲基化转移酶、去甲基化转移酶以及特异性结合蛋白共同调控。m6A修饰参与RNA生命周期的各个阶段,从RNA加工、出核、翻译到RNA降解。近期有研究显示,m6A修饰的异常发生不仅能够导致肿瘤的发生,也会影响致病病毒的复制及相关重要基因的表达,表明m6A修饰在致病病毒的复制及其致病过程中扮演着重要角色。m6A修饰在人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)、甲型流感病毒(IAV)、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒病(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、寨卡病毒(ZIKV)、肠道病毒71型(EV71)以及猴空泡病毒40(SV40)等病毒的复制及感染宿主过程中发挥重要作用。
由于m6A修饰的动态性和可逆性,导致它在不同病毒的复制或肿瘤的发生过程中发挥的作用有所差异。例如,在各个类型的病毒中沉默甲基化转移酶(METTL3)之后,对病毒复制具有抑制作用,例如HIV、IAV、KSHV、EV71、SV40;与之相反,对于HBV、HCV、ZIKV却促进它们的复制。即便针对于同一病毒,相同蛋白发挥的作用也不完全一致,例如YTHDF家族蛋白在HIV感染的CEM-SS T细胞和HeLa/CD4细胞均过表达之后,可促进CEM-SS T细胞中HIV病毒的复制,但是却抑制了HeLa/CD4细胞中病毒的复制。这可能是由于m6A修饰相关酶下游调控靶基因在不同类型病毒或者癌症中有所不同,因此筛选m6A修饰相关酶的下游靶基因对于阐明m6A修饰在病毒复制过程中的作用以及如何调控肿瘤的发生机制都十分重要。
结合m6A相关蛋白在病毒中的不同作用方式,针对m6A修饰中的甲基化转移酶、去甲基化转移酶及结合蛋白开发相应病毒的靶向小分子抑制剂或激活剂,以此破坏病毒对宿主的感染,这可能会提供一种潜在的抗病毒机制。最近的研究证实,利用甲基化转移酶抑制剂能够抑制病毒的复制,同时也能影响肿瘤的发生发展。因此,控制m6A水平的异常变化不仅可以对病毒起到抑制作用,而且对于一些肿瘤的治疗也有一定的价值。
虽然已有大量数据表明m6A修饰在病毒复制、相关结构基因的表达及癌症发生发展中的作用非常显著,但仍有许多问题需要做进一步的研究。至今,仍有部分病毒的复制及其与宿主的相互作用与m6A修饰间的关系尚未明确,例如,之前已有研究报道m6A修饰水平可正向调节HPV相关宫颈癌的发生过程,但是m6A修饰与HPV有何具体联系还需进行深入研究。此外,m6A修饰在一些病毒复制和癌症中的机制并非完全清楚,并且对于不同致病病毒的研究还不够深入,需要大量的基础研究来明确。目前的研究只针对病毒和肿瘤,对于正常的细胞是否有潜在副作用以及抑制剂的特异靶向性还需要大量研究进行验证。
九、展望
近年来,mRNA疗法研究取得了令人振奋的进展。就像许多人指出的那样,如果我们能真正驾驭mRNA疗法,对于医药行业会是颠覆性的。正是因为mRNA的潜力是可以合成任意一种蛋白,因此我们可以用它来开发传染病疫苗、开发组织再生疗法或是开发抗癌创新策略以及心血管系统、神经系统等疾病的新疗法。但实现这一目标,我们还有很长而艰辛的路要走。
新药研发是一条漫长的道路。在之前的新药研发传奇故事中,无论是被誉为抗癌史上奇迹的格列卫,还是人类历史上首款RNAi疗法Onpattro,又或是首款PD-1抑制剂Opdivo,都经历了数十年的研发历程。即便mRNA疗法能最终成为现实,这也是一项需要多年,甚至几十年才能实现的长期项目。而我们现在才刚刚起步。
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