补体旁路途径B因子异常活化与IgA肾病
发布时间:2020-12-17 11:47:43 | 来源:【药物研发团队 2020-12-16】
IgA肾病(IgAN)是最为常见的一种原发性肾小球疾病,是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主,伴或不伴有其他免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球病。病变类型包括局灶节段性病变、毛细血管内增生性病变、系膜增生性病变、新月体病变及硬化性病变等。其临床表现为反复发作性肉眼血尿或镜下血尿,可伴有不同程度蛋白尿,部分患者可以出现严重高血压或者肾功能不全。
lgAN目前被认为是世界上最常见的原发性肾小球肾炎,20%~40%的患者在20年内进展为终末期肾病(ESRD)。并且几乎所有心血管疾病的风险因素(高血压、血脂异常、吸烟等)都是导致lgAN加速进展为肾衰竭的危险因素。
经过50年的研究取得了不少进展,人们逐步认识到IgAN是一种免疫复合物介导的原发性肾小球肾病,是一种慢性进展性疾病。粘膜免疫异常,糖基化异常的lgA1及其抗体的产生以及免疫复合物在肾小球系膜区沉积并激活补体,肾小球的炎症、增殖和硬化等,在IgAN的发生发展中起着关键的作用。
迄今为止,lgAN确切的治疗方案尚未建立,现阶段治疗lgAN的目标仍停留在延缓IgAN进展(治疗方法包括预防及治疗感染、控制血压、控制血脂、抑制肾素血管紧张素-醛固酮系统等)。然而这些方法在防止IgAN进展为终末期肾病的效果相当有限。此外,终末期IgAN患者接受肾移植治疗后,移植肾短时间内会再次发生系膜区IgA沉积引起lgAN的复发。因此,关于lgAN存在巨大的未被满足的临床治疗学需求,IgAN的机制以及治疗问题亟待进一步研深入究。了解lgAN的疾病发生发展机制对于探索IgAN新的治疗方法至关重要。
细胞因子、炎性介质、遗传因素等均在肾病起病和进展中起到重要作用。IgAN病理特征在于半乳糖缺陷型IgA1(Gd-gA1)广泛沉积于肾小球系膜,然而含有lgA的沉积物的增殖和最终导致肾小球损伤的确切机制尚不清楚。近年来关于IgAN的研究逐渐深入到细胞、蛋白、补体甚至遗传基因水平。这些研究结果有利于在传统lgAN机制的上,更加精细地了解lgAN的病因,研究治疗方法,从而达到治疗IgAN,防止肾脏病变,保护肾脏的目的。
目前认为,IgAN的可能机制为糖基化缺陷的IgA1增多,与抗聚糖抗体结合为免疫复合物,沉积于肾小球系膜区,进而激活补体途径,导致免疫炎症反应。在补体激活的三条途径中,目前尚无充分证据表明IgAN与经典途径有关。IgAN中最常见的补体活化途径是旁路途径。多个研究发现IgAN患者肾组织中广泛存在旁路途径补体成分(B因子、P因子)及补体调节蛋白(H因子),同时,IgAN患者循环中也存在显著升高的B因子、H因子。因此,了解IgAN与补体活化旁路途径及补体因子B的关系,对于研发相关治疗药物具有重要意义。
一、IgA肾病
IgAN是最为常见的一种原发性肾小球疾病,是指肾小球系膜区以IgA或IgA沉积为主,伴或不伴有其他免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积的原发性肾小球病。病变类型包括局灶节段性病变、毛细血管内增生性病变、系膜增生性病变、新月体病变及硬化性病变等。其临床表现为反复发作性肉眼血尿或镜下血尿,可伴有不同程度蛋白尿,部分患者可以出现严重高血压或者肾功能不全。
二、IgA肾病相关生物标志物研究进展
利用分子生细胞物学、基因芯片、蛋白质组学、代谢组学技术和方法,检测血和尿中反映IgAN病变程度、类型、预后、治疗效果的特异性生物标志物正逐渐从实验室研究向临床过渡,为IgAN的诊断、疾病进展和预后预测、治疗效果评估提供无创、快捷、方便、准确的方法。
(一)IgA肾病诊断相关的生物标志物
lgAN发病机制虽未明,但四重打击致病机制学说逐渐被广泛接受。目前IgAN诊断无创生物学标志物主要是围绕“多重打击致病机制学说”第1和第2重打击机制进行相关的研究。
1、血清Gd-lgA
循环中Gd-lgA1水平增高是多重打击学说中的第1重打击。Moildoveanu等用ELISA方法测得153例高加索IgAN成人患者血清Gd-lgA1水平、结果显著高于健康人,此后也在不同人群中得到验证。在肾移植复发IgAN患者中,Gd-IgA1水平是疾病复发的独立危险因素。Gd-IgA1的检测效能主要依赖于凝集素结合试剂的敏感性。2015年日本团队研发了“不依赖于凝集素的特异性识别Gd-lgA1的单克隆抗体KM55”,它可以鉴别IgAN、血管炎性IgAN患者和继发性IgAN及其他肾脏疾病,诊断特异性较好,便于在临床上推广。然而25%~45% IgAN患者的一级亲属中也存在血青Gd-lgA1升高的现象,在双胞胎中更高,达80%,这表明血清Gd-lgA1具有遗传性,同时也说明了仅第1重打击不足以导致IgAN的发生。因此,血清Gd-lgA1在lgAN的诊断及IgAN肾移植后的复发有重要预测价值,但不能预测疾病严重程度,并且不能单用血清Gd-lgA1诊断IgAN,需要联合其它生物标志物共同诊断。有关KM55在IgAN无创诊断中的价值和运用还需进一步在大样本和多种族患者中去验证。
2、抗Gd-lgA1抗体
多重打击学说的第2重打击是抗Gd-lgA1抗体的产生。抗Gd-lgA1抗体有lgA和lgG两种形式,lgAN患者血清中抗Gd-lgA1抗体的表达量明显高于健康对照及其他肾病对照,对IgAN诊断的敏感性和特异性分别达95%,88%。研究发现,在lgAN患者中,血清IgG升高患者的肾脏存活率更高,肾活检时血清IgG水平低与肾预后不良相关。在对肾移植复发IgAN患者进行平均5.8年的随访研究,发现只有抗Gd-lgA1的IgG抗体是移植肾复发的独立危险因素。抗Gd-lgA1抗体是lgAN发病机制中重要环节,因此,在检测试剂效能好的情况下,有望成为诊断IgAN的生物标志物。
3、核酸类
miRNA长度为20-25个核苷酸,存在于血液、尿液、胆汁等多种生物体液中,具有很高的生物稳定性。越来越多的证据表明,它参与IgAN的发生发展,在IgAN中发挥重要作用。近年来,miRNA作为一种新的、特异性和非侵袭性生物标志在lgAN中也受到了越来越多的关注。
4、长链非编码RNA(IncRNA)
不具备编码蛋白能力,长度>200个核苷酸,多数会形成更稳定的二级结构,可在血液中检测到,较miRNA可能具有更好的组织特异性,并且参与机体的分化、增生、转移等多种病理生理过程。外泌体内富含IncRNA等生物信息,因受双层膜结构保护,具有较高的稳定性。研究证实血浆外泌体IncRNAG21551表达量较其一级健康亲属显著下调,这提示外泌体IncRNA可望成为诊断IgAN的新型生物标志物,可能是将来研究的方向之一。
综上所述,目前尚未寻找到单一的特异性和敏感性好的生物标志物用于IgAN无创诊断,因此,组合不同有价值的生物标志物,如Gd-IgA1、抗Gd-lgA1抗体以及联合miRNA-148与Let-7b等进行建模预测将可能会更加有效,这也可能是将来无创诊断的重点。
(二)IgA肾病进展和预后评估的生物标志物
近年来,在IgAN生物标志物研究的重点和热点多集中在疾病进展和预后相关的生物标志物,以下按照蛋白类、细胞因子、核酸类、足细胞标志物逐一论述。
1、蛋白类
(1)补体调节蛋白
现已证实,补体旁路激活途径和甘露糖结合凝集素(MBL)途径参与了IgAN的发生发展,在IgAN发病机制中起重要作用。IgAN患者肾组织中常伴有 C3、备解素、MBL的沉积,血清C3下降及系膜区C3沉积已被证实与肾功能损害相关。最近一项针对中国1356例IgAN患者的研究发现,血清C4水平也与尿蛋白排泄正相关,与肾小球滤过率(eGFR)负相关;血清C4水平随肾小管间质损伤程度、肾小球硬化程度加重而升高,表明血清C4是IgAN预后的独立危险因素。此外,H因子相关蛋白(FHR),包括FHR1和FHIR5,可拮抗FH对补体旁路途径的抑制功能。研究发现,高FHRI、FHRI/FH的lgAN患者,其血清Gd-lgA1水平更高,且肾功能进展更快;血清FHR5在IgAN患者中升高,但与eCFR不相关,较高的血清FHR5水平与免疫抑制反应、毛细血管内皮细胞增生和病理组学评分严重程度(牛津MEST评分)相关。 MBL水平与IgAN患者肾脏预后存在非线性关系,低MBL(<100 ug/L)的患者,前驱感染和血尿发生率高于MBL水平在100-3540 ug/L的患者,低MBL与肾脏预后差有关;但高MBL(>3540 ug/L)患者蛋白尿更严,病理新月体比例更高。MBL水平较高或较低均可能对lgAN进展产生不良影响,说明MBL通过多种机制参与了IgAN的发病过程。
(2)肾损伤分子-1
肾损伤分子1(KIM-1)是一种跨膜糖蛋白,在正常肾脏中不表达,而在受损后再生的近曲小管上皮细胞中表达显著增强,是检测肾损伤的生物标志物。研究发现,尿KIM-1在IgAN患者中的水平高于健康人,KIM-1是预测IgAN患者ESRD的独立因子。
(3)基质金属蛋白酶
基质金属蛋白酶(MP)是人体内主要分解细胞外基质成分的蛋白水解酶,其对维持肾小球正常代谢有着重要作用。表明尿MMP-7是独立预测IgAN进展的因子,其优于之前报道的尿血管紧张素原、EGF、KIM-1等生物标志物。
2、细胞因子
细胞因子参与肾小球疾病免疫发生机制,在细胞增殖和肾小球硬化中起重要作用,现研究已证实血清中的细胞因子也可作为IgAN的疾病进展预测因子。
(1)成纤维生长因子
IgAN患者血中成纤维细胞生长因子(FGF23)与蛋白尿和肾病进展有关,较高的FGF23水平提示肾功能的快速下降,FGF23可作为IgAN患者肾病进展的潜在生物标志物。Fractalkine,即CX3CLL,在细胞膜表达,也可以可溶性形式作为CX3CR1细胞受体的惟一配体。提示血浆fractalkine 可能是IgAN患者潜在的疾病进展预测因子。
(2)白细胞介素
白细胞介素类(L)是免疫细胞间相互作用的淋巴因子,在IgAN的发生、发展中起重要作用。研究发现,IgAN患者存在高表达水平的IL-2、IL-2受体(IL-2R)和可溶性白介素2受体-a(slL - 2Ra)。slL-2Ra与lgAN患者年eGFR下降斜率、肾小管萎缩间质纤维化程度显著相关。因此,血浆slL-2Ra的水平可预测IgAN患者的长期肾脏预后。
(3)单核细胞趋化蛋白-1
单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)由单个核细胞和其它非白细胞分泌,主要功能是趋化、激活单核-巨噬细胞,并在肾组织浸润,从而损伤肾组织。Torres等通过多变量回归分析发现,尿液MCP-1升高可作为IgAN进展为ERSD的独立预测指标。研究发现,组合不同的细胞因子用于预后的评估可能会更加有效,如把IL-6结合表皮生长因子(EGF)。Ranieri等研究发现,IgAN患者尿IL-6水平升高和EGF水平降低的程度与病理组织学损伤程度、高血压、血肌酐水平相关,尿IL-6/EGF比值高者在随访3年后肾病进展最为明显。因此,尿IL-6/ECF比值可作为评估IgAN疾病进展的指标。
3、足细胞标志物
足细胞标志蛋白(PCX)是存在于足细胞顶端质膜上的跨膜蛋白,参与维持足细胞正常的形态和功能。研究表明,伴有节段性硬化的IgAN患者尿中足细胞的数量及PCX水平显著高于无节段性硬化者,提示尿足细胞数量、尿液PCX水平与IgAN患者肾小球损伤的严重程度相关,因此,尿足细胞及足细胞标记蛋白有助于lgAN的预后评估。Dendrin是一种存在于足细胞裂孔隔膜上的蛋白,在足细胞损伤时可易位至细胞核。Kodama等研究发现,IgAN患者肾小球急性损伤时,尿液中凋亡足细胞核可检测到dendrin表达,且表达量较病变轻微的患者显著增多。提示尿中足细胞核dendrin表达可以反映IgAN疾病的活动程度。
4、核酸类
越来越多的研究证实了nckNA作为lgAN预后评估的生物标志物的优势和潜力。Wang等研究发现,IgAN患者尿miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-429表达水平明显低于健康对照组,与蛋白尿程度呈负相关;尿miRNA-200b和miRNA-429与基础肾功能水平呈正相关。Wu等研究发现,lgAN患者血浆miRNA-148a-3p水平与eGFR正相关(r=0.25,P=0.02) ,表明血浆miRNA-148a-3p水平可能反映eGFR的变化趋势。
Hu等研究发现,血浆miRNA-29a也与eGFR呈正相关,与蛋白尿负相关,血浆miRNA-29a水平与较重病理改变(如新月体形成,Lee分级和牛津分型)呈负相关(P<0.05);高表达miRNA-29a的IgAN患者具有更好的肾功能,治疗反应也较好(P<0.05)。
LncRNA-H19基因位于人类染色体11p15.5,全长约2.3kb。研究表明,LncRNA-H19在IgAN患者肾组织中的表达与Lee分级相关,与eGFR呈正相关,血清IncRNA-H19具有较高的检测灵敏度,有望成为动态检测IgAN病情进展的标志物。Wang等发现,在58例IgAN患者中,肾脏IncRNA-TSI表达水平与肾纤维化指数呈负相关(r=-0.56,P<0.001);随访观察48个月后行重复肾活检,初次活检时肾脏IncRNA-TSI表达低的患者肾脏纤维化指数明显增加,表明IncRNA-TSI可作为反映肾脏纤维化程度进展的生物学指标。
在外泌体相关的研究方面,近来发现,尿液外泌体CCL2 mRNA可作为IgAN患者活动性肾脏病理损伤和肾功能恶化的生物标志物。肾穿刺活检时尿液中外泌体高表达CC12 mRNA的患者具有更差的肾功能和预后。
5、预测模型
对于lgAN,仅凭临床资料或单个生物标志物预测疾病进展风险的效能不高,因此,结合全面临床、病理变量并利用先进的人工智能算法,对IgAN预后的评估,以及指导患者个体化治疗至关重要。刘志红院士团队通过人工智能建立了lgAN患者肾脏预后预测工具一南京IgAN危险分层系统(NJIgAN-BSS),该系统包含了可精准预测肾脏预后的机器学习模型XGBoost以及简化的危险分层模型,并对其进行了外部验证,在训练集及验证集上的C-statistics分别为0.89、0.84。侯凡凡院士团队将临床、病理与生物标志物3种指标相结合,建立预测IgAN进展风险模型。研究显示,在试验队列(554例,中位随访40个月)和验证队列(392例,中位随访28个月)中,单独使用尿液MMP-7预测IgAN进展的C-statistics分别为0.78和0.72;将尿液MMP-7与临床资料、肾活检病理资料相结合,其C-statistics在两个队列中可分别提高到0.85和0.81;在未使用RAS阻断剂的患者中,三者联合预测的C-statistics最高,达0.86。Barbour等纳人欧美、中国、日本共3927例患者(2781例患者构建预测模型、1146例患者验证),建立可预测患者肾功能恶化风险的工具,该模型具有较好的预测性能(Cstatistics 0.82;95% Cl: 0.81 ~ 0.83),可简单、方便、准确地预测IgAN患者肾病进展风险,目前也逐渐在日常临床决策及临床试验中运用。
因此,将临床、病理和生物标志物三者结合,综合多种危险因素,以人工智能等为工具建立预测模型,将显著提高IgAN预后的预测效能,在未来辅助医生为不同患者提供个体化的治疗方案,以实现对lgAN患者的精准治疗,从而改善肾病患者的长期预后。
(三)IgA肾病药物治疗疗效相关的生物标志物
目前与lgAN患者药物治疗效果相关的特异性生物标志物研究并不多。意大利的一项对18例长期服用ACEI (雷米普利)IgAN患者和20例健康对照组的一项尿蛋白质组学分析的研究,发现ACEI治疗敏感组和低反应组患者间存在尿激肽原、a-胰蛋白酶抑制剂重链4和甲状腺素运载蛋白等3种差异表达的尿蛋白组分,进一步验证结果显示,低水平尿激肽原排泄率可预测IgAN患者对ACEI治疗的低反应性。杨琼琼等前期研究纳入80例接受厄贝沙坦(ARB)治疗IgAN患者(低反应组40例,敏感组40例),蛋白质组学分析结果显示,ARB低反应组和敏感组患者之间共鉴定出77个差异表达蛋白,进一步验证发现,ARB治疗低反应组患者尿液中维生素D结合蛋白(VDP)的表达水平较敏感组显著降低,其作为预测ABB治疗反应性的敏感性和特异性分别为65%和85%。一项通过对比分析52例IgAN患者和25名健康对照者尿沉渣差异miRNA的研究发现,在接受激素和(或)免疫抑制剂治疗的患者中,完全缓解组的基线miR146a水平显著低于非缓解组;而在单用RASI治疗的患者中,完全缓解组的基线miR-205水平显著高于非缓解组(P=0.018),提示尿沉渣miR-146a、miR205的基线水平可能是IgAN患者疗效预测的指标。以上研究提示,可能存在可用于预测RASI激素和(或)免疫抑制剂治疗疗效的生物标志物,但仍有待于进一步研究。
三、IgA肾病病理诊断方面的研究进展
长期以来,IgAN组织形态学病变程度的判断分为两大类,一是小球、小管、间质、血管各项指标的半定量积分,如0,1,2,3,分别代表某项病理改的无、轻、中、重,最后以总分表示病变的程度。Katafuchi积分,这种半定量分析比较全面,也比较细,但评分很费时间,多用于临床病理研究,很少在肾活检病理报告中应用。另一类是肾脏病理改变笼统的分级,如Lee和Haas分级以及参照狼疮肾炎WHO病理形态学分类的分级,但这些分级标准不太一致,Lee和Haas均根据病变的严重程度和病变的类型,分为I、II、III、IV、V级,但内涵不一样。更为重要的是,这些分类法中使用的病理学变量没有准确的定义、使用的术语含糊、缺乏可重复性、是香与预后和治疗有关不清楚。为了能正确地理解lgAN病理与临床的关系、病理对预后判断的指导意义,在统一标准的情况下进行学术交流、开展多中心的前维性的临床治疗试验,非常有必要。制定具有重复性好、与临床紧密相关、能预测预后、对治疗有指导意义、易于操作的lgAN的病理分类。
四、IgA肾病治疗方面的研究进展
对于血压正常或偏高、肾功能正常、轻到中度蛋白尿的IgAN患者,应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)能减少尿蛋白、保护肾功能。对于中度蛋白尿、肾功能轻中度异常的IgAN患者,使用ACEI/ARB也有肾脏保护作用。
糖皮质激素和免疫抑制剂治疗IgAN的有效性和安全性仍存在争议。荟萃分析结果显示,对轻中度肾组织损害者糖皮质激素降低尿蛋白的作用是肯定的,但难以说明对肾功能的保护作用。对于肾功能轻到中度异常(GFR下降超过40%,133 umol/L <血肌酐< 250 umol/L) IgAN的RCT研究表明,糖皮质激素联合细胞毒药物治疗能保护进展性IgAN肾功能、降低尿蛋白、改善病理损伤。但是长期预后及副作用不很清楚。
五、IgA肾病扁桃体摘除的再认识
由于许多IgAN患者扁桃体急性感染,容易出现肉眼血尿或尿检异常加重;沉积在肾小球系膜区的IgA和扁桃体淋巴细胞产生的IgA都主要是多聚型lgA1;部分IgA肾病患者血清IgA升高,扁桃体摘除可以降低血清IgA水平,因此认为IgAN与扁桃体有密切的关系。但是IgAN是否建议摘除扁桃体没有一致的意见。
重复肾活检的研究表明,IgAN患者在糖皮质激素、抗血小板药和扁桃体摘除综合治疗后,肾脏组织学病变明显改善,绝大多数患者活动性的肾脏
病变消失,系膜增殖和间质单核细胞漫润显著减少,大部分患者系膜区IgA沉积强度减弱,部分患者IgA沉积消失。因此建议,IgAN的成人患者,如果扁桃体肿大并经常感染、发热,而且每次发炎时血尿和蛋白尿都加重,应摘除扁桃体。
综上所述 IgAN的研究近年来取得了很大的进展。随着科学技术的发展,循环中糖基化异常的IgA1 (Gd-lgA1)及其抗体的检测可能成为IgAN无创诊断的工具。由于肾小球是否有新月体以及新月体的程度对治疗和预后都有重要影响,因此,新版的IgAN牛津分类的肾活检报告,除了系膜细胞增生、肾小球节段硬化或粘连、毛细血管内细胞增多、肾小管萎缩或肾间质纤维化外,推荐增加有无细胞和(或)纤维细胞性新月体及其程度的描述。由于免疫异常和补体活化在IgAN的发生发展中起着重要作用,糖皮质激素和免疫抑制剂对于减少蛋白尿和延缓肾功能恶化具有一定的作用,但是其长期预后和药物的副作用问题,使得人们不得不进一步探索其安全有效的剂量、疗程、配伍和给药途径。扁桃体摘除是否会使IgAN患者获益还有争议,但对于扁桃体感染后血尿、蛋白尿明显加重的轻中度IgAN患者建议行扁桃体摘除。
六、IgA肾病实验动物模型研究进展
由于IgAN发病机制至今尚不明了,目前尚无有效的特异性治疗方法,因此,IgAN实验动物模型的研究对促进IgAN发病机制研究、寻找安全有效的治疗方法具有重要价值。目前,针对从IgAN可能的发病机制的实验动物模型主要有以下方面。
(一)免疫复合物诱导的IgA肾病实验动物模型
通过静脉注射来源于小鼠少突胶质前体细胞(MOPC)-315杂交瘤小鼠的IgA抗二硝基苯基(DNP)与DNP化的牛血清蛋白生成的免疫复合物诱导Balb/c小鼠肾小球系膜区出现显著的免疫复合物沉积。
(二)病原微生物成分诱导的IgA肾病实验动物模型
每周给小鼠鼻内注射灭活的仙台病毒悬浮液,并接受2次静脉注射仙台病毒进行感染,诱导IgAN实验动物模型。
(三)异种蛋白诱导IgA肾病实验动物模型
大鼠口服牛血清蛋白(BSA)+脂多糖(LPS)+四氯化碳(XCL)诱导IgAN实验动物模型。
(四)IgA1糖基化异常相关的小鼠IgA肾病模型
将人免疫球蛋白基因转入小鼠后,注射异常糖基化人IgA1诱导IgAN实验动物模型。
(五)黏膜免疫的IgA肾病实验动物模型
小鼠或大鼠口服或鼻黏膜接种疫苗,诱导IgAN实验动物模型。
(六)黏膜外免疫IgA肾病实验动物模型
腹腔注射葡萄糖右旋糖酐诱发小鼠体液免疫,随后反复静脉注射,诱导IgAN实验动物模型。
(七)B细胞转化异常IgA肾病实验动物模型
B细胞中的抗凋亡因子bel-2具有改善B细胞生存及延迟细胞周期C1-S等作用,E2F1能控制细胞周期也具有诱导细胞凋亡的功能。E2F1基因敲除小鼠与bel-2转基因小鼠杂交后代自发自身免疫疾病,lgA沉积于系膜,同时伴随IgM和IgG沉积,但其血清中主要以抗DNA抗体IgG升高为主。该模型可能只是一种以肾腔损伤为主的轻度的自身免疫综合症,无法全面模拟人类lgAN,但其有利于研究IgAN发病的免疫学机制。
肿瘤坏死因子(TNF)家族成员B细胞活化因子(BAFF)是由多种细胞(包括单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞和间质细胞)产生的B细胞生存因子。已证实BAFF能诱发不依赖干T细胞的lgA与lgG类别转换1。大多数BAFF-Tg小鼠8周龄时系膜区出现lgA沉积,伴随不同程度的IgG沉积,血中的IgA糖基化异常,呈多骤体状态,与外泌型成分无关等方面与人类IgAN相似。但有部分lgAN患者出现BAFF信号通路异常,且该模型小鼠无明显血尿、造模时间较长、仅有部分系膜细胞增生等缺点限制了其在lgAN研究领域的应用。
(八)T细胞调节异常IgAN肾病实验动物模型
ddY小鼠是目前国外常用的一种自发性IgAN模型,可分为早发型、迟发型和静止型。 Suzoki等发现早发型ddy小鼠表现为强烈的Th1极化,而静止型则为Th2极化。利用此模型可研究T细胞在lgAN不同阶段的作用。但此模型不足之处在于远交系的小鼠发病年龄和疾病的严重性具有高度可变性,再者ddy小鼠血清IgA的水平与肾小球损伤的严重性和疾病的发生率无相关关系。
鉴于上述缺点,Okazaki等"通过早发型ddY小鼠互交20代以上建立了一种特殊的ddY小鼠,命名为化合ddy小鼠。这种小鼠IgAN发病率达到100%,出生8周后便出现蛋白尿及严重的肾小球和小管间质损伤。同时化合ddY小鼠继承了早发型IgAN四种易感基因座(lan1、Igan2、Igan3、Igan4)。化合ddY小鼠具有造模时间短、发病率高、病变及基因特征与人类IgAN相似等优点,使其有望成为IgAN模型的优先选择。但其价格昂贵、获取不易可能会成为其广泛应用的桎梏。
(九)IgA受体相关模型
Launay等成功制作CD89转基因小鼠。这种小鼠自发IgAN,表现为系膜区IgA沉积、系膜基质增生、肾小球和间质巨噬细胞浸润、血尿、蛋白尿等。重组活化基因(RAC)2小鼠注射该基因后,或重症综合性免疫缺陷(SCID)转基因小鼠注射患者IgA后同样能诱发IgAN,而清除血浆中的CD89后该作用消失。但最近有报道IgA-sSCD89复合物也存在于对照组中,且sCD89与lgAN的进展有关而与其易感性无关。因此, IgA-sCD89复合物在人类IgAN的致病作用仍需进一步探索。
四氯化碳可引起严重的肝损伤进而导致肝硬化,肝脏去唾液酸糖蛋白受体(ASCPR)大量减少,血中IgA清除不足。由此制备的模型会出现以蛋白尿和血尿为特征的IgA,其严重性与血中IgA及其免疫复合物含量相关。但此模型肝损伤重、动物死亡率高,限制了其实际应用。
(十)继发病变型模型
在生理状况下,人体的肝脏会清除体内约90%的IgA,若肝脏发生病变,其清除能力会下降,体内未被及时清除的lgA便容易形成免疫复合物,进而沉积在肾小球系膜区。继发病变型模型多采用肝脏切除或诱导动物肝硬化的方法使肝脏清除IgA的能力显著降低,因此实验动物通常会表现出非常明显的IgA沉积。但是该模型容易导致动物出现严重的肝功能损害,且动物存活率较低。正是由于动物的高死亡率等弊端,目前该模型已很少使用。
综上所述,IgAN是一个多种致病因素参与的疾病,其发病机制众说纷纭,至今没有较统一的说法。根据不同发病机制而制作的动物模型也是多种多样。再者,啮齿类动物与人类存在一定的差异,目前还没有一种理想动物模型能够较好地模拟人类IgAN的临床表现和病理特征。现已有越来越多的学者利用其扎实的理论知识及先进的实验技术在探索IgAN动物模型的建立,相信今后将会有更贴近人类IgAN的动物模型出现,为IgAN的防治打下坚实基础。
七、补体活化旁路途径、补体因子B与IgA肾病
补体的激活在IgAN的发病机理和临床表达中起关键作用。该过程通过旁路途径介导,并且可能发生在全身含有IgA的循环免疫复合物上或局部存在于肾小球中。旁路途径调节基因对疾病表达影响正逐步显现,并成为lgAN发展的一大重要因素。
旁路活化是IgAN中最常见的补体激活途径。IgAN患者肾组织中广泛存在旁路活化补体成分B因子、P因子及补体调节蛋白H因子,同时,IgAN患者循环中也存在显著升高的B因子、P因子。
(一)补体活化旁路途径
旁路活化途径是补体激活三条途径之一,是指微生物或外源异物直接激活C3,在B因子、D因子和备解素参与下,形成C3转化酶与C5转化酶,最终形成攻膜复合物。
旁路活化途径与经典活化途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分,直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应,还在于激活物质并非抗原抗体复合物而是细菌的细胞壁成分—脂多糖,以及多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG4等物质。旁路活化途径在细菌性感染早期,尚未产生特异性抗体时,即可发挥重要的抗感染作用。
补体旁路途径激活时,C1、C2、C4不参与,而C3、C5~C9及B、D、P、H、I因子参与。EGTA(乙二醇双α-氨基乙基醚四乙酸)螯合样品中的Ca2+,可起封闭C1作用而阻断传统补体途径激活。加入可使B因子活化的兔红细胞(RE),激活补体旁路途径,即导致RE溶血。补体活性与溶血程度呈正比关系,也以50%溶血(AP-H50)作为检测终点。试管法检测参考值为21.7±5.4u/ml。
在参与补体旁路途径活化的C3、C5~C9、B、P、D因子等成分中,任何成分异常都可致AP-H50的改变。AP-H50增高见于自身免疫病(如SLE)、风湿热、结节性动脉周围炎、皮肌炎、肾病综合征、慢性肾炎、恶性肿瘤和伤寒等;AP-H50降低见于肝硬化、慢性活动性肝炎、急性肾炎等。
(二)补体因子B
补体因子B为C3激活剂前体,是补体旁路活化途径中的一个重要因子,主要由肝脏和巨噬细胞合成。它是参与补体旁路活化的重要成分,参与机体防御,在组织和细胞损伤和炎症过程中均起重要作用。其正常值为0.10-0.40g/L。
(三)补体旁路途径激活部位
补体旁路途径可以直接在肾脏免疫沉积中原位激活。该发病机制可能与调控旁路途径的遗传缺陷(如CFHR5基因的内部重复)或获得的过量旁路途径激活(存在C3肾炎因子)驱动。研究数据表明:肾小球C3沉积可能受到由免疫复合物的旁路途径的调节缺陷的影响;单独的C3沉积可诱导IgAN中与之类似的肾小球损伤。肾小球系膜细胞已被证明是驱动肾小球炎症的局部补体参与者。系膜细胞产生FH186,并且在炎症环境(IL-1或TNFa)中可产生C3。此外IgAN中的自身抗原(聚合的Gd-lgA1)本身可刺激肾小球膜细胞产生和分泌C3。活化产物C3a和C5a可以诱导培养的人肾小球系膜细胞产生DAF(一种旁路途径的有效膜结合调节剂)。通过原位杂交肾小球膜细胞在IgAN中的DAF和C3mRNA的表达证实其为相对特异性的疾病。C3a,通过C3裂解产生的过敏毒素诱导培养的肾小球系膜细胞的分泌表型,其特征在于编码细胞外基质(胶原IV,骨桥蛋白和基质Gla蛋白)组分的基因表达的增加。这种转变可以解释通常在IgAN患者的肾活检中观察到的肾小球系膜基质的体内扩增。该作用已经显示出依赖于C3a受体的作用,但另一项使用原位杂交的研究未能在正常情况下发现C3a受体表达人类肾小球系膜细胞。
在IgAN患者中,含lgA1的循环免疫复合物是否具有补体因子作用尚不清楚。然而,lgAN患者中C3衍生产物的血清浓度升高表明旁路途径的可溶相激活。对患者循环免疫复合物的蛋白组学及体外复合物Gd-IgA1和抗糖链IgG的分析表明了C3的存在。在此研究中,高分子量级分中可检测到裂解产物(iC3b,C3c,C3dg和C3d),这表明旁路途径的激活及调控也直接发生在免疫复合物上。
(四)旁路途径的激活
超过90%的IgAN患者中存在补体C3的沉积。75%~100%的患者中存在备解素、IgA、C3的共同沉积,30%~90%患者中存在FH沉积。补体旁路途径的激活导致HI-、FH-及补体受体1的积累,进而诱导C3水解成蛋白片段(如iCb、C3d)。已经发现这些片段在IgAN患者的血浆中的浓度是升高的。在一项研究中证实其与病理严重程度相关。在另一项研究中则证实其与预后相关。70%的儿科IgAN患者中也存在循环C3产物增多的现象。
在体外实验中,已经证实IgAN的补体激活旁路途径。在特殊条件下,人类Fab片段亦能激活补体旁路途径。研究表明尽管IgA1及其Fab片段能减少IgG介导的补体经典途径,表面结合的IgA1能激活旁路途径 。由lgA介导的补体旁路途径激活的机理仍然知之甚少,但被认为需要稳定状态的C3转化酶。
(五)补体旁路途径调控相关蛋白
IgAN中几个补体成分或调控蛋白部分缺陷已被证实。与补体旁路途径调控相关的三个蛋白成分包括备解素、FH和FI,这些发现可能表明,补体旁路途径相关蛋白成分低于正常血清水平将影响IgAN的进程及预后。
(六)补体旁路途径因子作为一种生物标记物
目前认为血清补体蛋白水平可作为IgAN预后的生物标记物。一项研究显示,血清C3水平(小于90mg/dl)降低提示肾脏预后差。在亚洲的几项研究中,高血清IgA:C3比率与疾病进展相关。但这些数据需要在其它队列研究中进行进一步试验,以确定低血清C3水平作为预后生物标志物。在另外两项研究中,与健康人群相比,IgAN患者中血清FH、FI、FB和备解素水平增多。
尿中补体成分也将作为IgAN一种新型活性的生物标志物。尿液中FH和可溶性C5b-9水平与蛋白尿、血清肌酐增加,间质性纤维化和全球肾小球硬化的百分比正相关,而尿中备解素水平仅与蛋白尿相关。与健康对照组相比,这些生物标志物在IgAN患者尿液中含量明显增多。另一项研究描述了随着尿中FH含量增多,组织学病变更严重。但上述研究并未包括具有蛋白尿的疾病对照以评估由损伤的肾小球滤过屏障引起的非特异性排泄。
肾活检的补体免疫染色是另一种潜在的评估预后的生物标志物。在一项对伊朗患者的研究中,肾小球系膜C3与血清肌酐水平升高、新月体比例增高,以及毛细血管内细胞过多,肾小球系膜细胞和节段性硬化有关。有趣的是,在一项对韩国患者的研究中,血浆低C3与肾小球系膜区C3沉积强度正相关,且是进展为ESRD的危险因素。
八、补体因子B基因遗传多态性与IgA肾病发病和预后的关联性
IgAN的病因和发病机制目前尚未阐明,IgAN的特征性病理表现是以lgA为主的免疫复合
物在肾小球系膜区的沉积,是一种免疫炎性反应介导的肾炎。既往研究提示,约80%的IgAN患者肾组织同时有C3的沉积。lgA分子本身可以激活补体旁路途径,提示补体旁路途径的活化与IgAN发病有关。Onda等的研究发现,多个参与补体旁路途径活化的因子在IgAN患者的血浆水平比正常健康人显著增高,lgAN患者肾组织有补体旁路途径的多个因子沉积,且与临床和病理改变程度相关,lgAN患者尿液中补体激活因子水平也较正常健康人升高。以上研究均提示旁路途径是IgAN中补体活化的一条重要途径。
B因子如果出现异常,就可能出现整个旁路激活途径反应的“扩大化”,攻击自体细胞,造成自身组织的损伤而导致自身免疫性疾病。在多种自身免疫性疾病,如ANCA相关性血管炎(AAV)、狼疮肾炎等都有B因子参与发病的报道。B因子的基因多态性位点以及基因突变可能引起B因子功能改变。已有B因子基因的遗传改变参与自身免疫性疾病老年黄斑变性(AMD)和非典
型溶血性尿毒症综合征(aHUS)发生的报道。B因子中rs12614和rs641153共同编码Ba片段第32位氨基酸,即精氨酸(fb32R)、谷氨酰胺(fb32Q)、色氨酸(fb32W)。Montes等研究发现,编码fb32Q的等位基因在老年黄斑变性的发病中起保护作用,而编码fb32R的则是危险的等位基因,fb32w处于中间位置,其机制是fb32R与C3b亲和力比fb32Q高3倍,更易与C3b形成C3转化酶,扩大补体旁路途径反应,从而对自体细胞造成损伤。除了上述两个单核苷酸多态性(SNP)位点,B因子的rs4151667在AMD的研究也较多,虽然结论并不一致,但是不排除B因子的基因多态性参与AMD发病。此外,有研究发现,在aHUS患者中,B因子基因突变导致第323位、第286位氨基酸改变(K323E,F286L.),引起B因子的功能改变,导致C3转化酶形成增加以及降解减少,通过影响补体旁路途径活化而参与aHUS的发病。
众多研究证实在IgAN患者的血循环和尿液中能检测到显著升高的补体活化产物,在肾组织中有补体成分的沉积。Zwiner等研究发现活化的补体成分活性C3与IgAN的进展密切相关。C3转化酶的形成是补体活化过程中的核心环节,在旁路途径中,B因子与C3b结合,在D因子的作用下形成C3bBb,即C3转化酶,进一步引起后续“瀑布”反应。B因子是旁路途径的特异性因子,是C3转化酶的重要组成部分。在多种自身免疫性疾病中,B因子遗传改变而引起的B因子功能异常,包括影响与C3b的结合能力、C3转化酶稳定性,进而引起旁路途径异常,是引起某些自身免疫性疾病发病的机制。
翟亚玲等选取继往报道的参与aHUS发病的功能性B因子多态性位点rs12614、rs641153,及其相邻的两个位点r54151667、rs117314762进行研究。结果提示B因子的rs117314762位点与IgAN发病相关,此位点的GG基因型是IgAN发病的危险性基因型。B因子中rs117314762多态位点位于2号外显子,该位点可以引起所编码的氨基酸由精氨酸到组氨酸的改变(Arg—>His),但目前尚缺乏对此多态位点的功能意义研究。翟亚玲团队的研究明确了B因子中rs5117314762多态位点与IgAN发病的关联,提示补体B因子或其所在区段可能有与IgAN发病相关的功能变异,有待进一步研究对这一潜在的功能变异进行发掘和证实。在继往研究中发现的与aHUS发病相关的B因子rs12614、rs641153位点,该研究中未发现其与IgAN发病的显著关联,不提示与aHUS相同的B因子rs12614、rs641153参与IgAN发病的机制。
在翟亚玲的研究中仅选取了少数既往报道的功能性SNP位点进行初步探索性研究,为探讨补体B因子基因遗传多态性与IgAN患者发病和预后的关联起到了提示作用,希望未来能在其他种族的独立样本人群中进行验证。除了该研究检测的4个SNP位点外,B因子中还存在其它众多遗传多态性位点,如Kaur等报道的在印度人群中对AMD发病有保护意义的rs2072633位点,由rs547154与rs641153组成的TA单倍型也与AMD的发病相关。有报道3个GWAS研究也检测了一系列B因子上的遗传多态性位点,但都未发现所检测的B因子的遗传多态性位点与IgAN发病有关。B因子以及与B因子基因连锁的遗传区段中是否存在其他和IgAN关联的功能性SNP位点,值得进一步深入研究探讨。
在探讨B因子的遗传多态性对IgAN患者疾病进展及预后的影响中,尚未发现B因子基因的rs12614、rs641153、rs4151667和rs117314762位点与起始尿蛋白、时间平均尿蛋白、收缩压、舒张压、时间平均动脉压、肌酐、eGFR、eGFR下降速率、使用激素和(或)免疫抑制剂情况等临床指标和治疗方面相关,进一步的预后分析也不支持补体因子B的4个SNP位点是IgAN预后的危险因素。相关研究的结果未发现补体因子B基因的遗传多态性与IgAN的进展和预后相关联。
综上所述,研究发现补体因子B基因的rs117314762位点与IgAN发病的遗传易感性相关联,提示补体因子B或其所在区段可能有与IgAN发病相关的功能变异,需要进一步研究证实。
九、IgA肾病相关补体抑制剂
补体系统异常活化及其产物是介导肾脏免疫炎症的关键因素,补体异常活化及其产生的过敏毒素是研究的热点,是疾病防治的新方向。付金容等发现在心肌的缺血再灌注中,补体1抑制剂可抑制补体关键蛋白C3的合成,调节缺血心肌炎性反应,从而保护缺血心肌。而对于IgAN,目前也建立了多种在补体激活的各个位点进行抑制性阻断的临床试验。
(一)抗CS单克隆抗体Eculizumab
Eculizumab是一种选择性地抑制C5的重组单克隆抗体,能防止C5a释放和膜攻击复合物(MAC)形成。目前,Eculizumab已被批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿和非典型溶血性尿毒症综合征。有3例IgAN患者在接受其他免疫抑制治疗效果欠佳后采取了Eculizumab治疗。ROSENBLAD等及RING等均发现使用Eculizumab后肾功能有短暂改善。但由于在使用Eculizumab前均使用了其他免疫抑制剂治疗,肾功能改善是否归因于Eculizumab尚不明确,不能排除使用Eculizumab时之前大量治疗恰好正起作用。HERZOG等使用Eculizumab治疗同种异体移植物是失败的。虽然目前对Eculizumab适应证剂量、监测和最佳时间方面均没定论,但可认为使用Eculizumab与暂时性肾功能和蛋白尿稳定以及停药后疾病进展有关。
(二)C5受体抑制剂Avacopan
Avacopan是一种选择性C5a受体抑制剂,通过与C5a受体结合以对抗补体依赖性炎症的小分子。相对Eculizumab,Avacopan不影响C5b和MAC形成,而C5b-9对脑膜炎奈瑟菌等病原菌有防御作用。目前已经有两项Avacopan治疗活动性ANCA相关血管炎(AAV)的II期临床试验,发现Avacopan与大剂量皮质激素具有类似的疗效,且没有检测到特定的不良反应。对此JAYNE等认为Avacopan可能是糖皮质激素的有效替代品。ZHANG等认为抑制C3和C5受体可能是治疗IgAN有潜力的干预措施。研究发现IgAN小鼠实验模型与正常小鼠相比,缺乏C3和C5受体的小鼠有较少蛋白尿、系膜IgA沉积、系膜基质扩张和细胞增生。目前一项I期临床研究正在进行,旨在对接受最大剂量肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)阻断剂的IgAN患者给予Avacopan,探讨减少蛋白尿的安全性、耐受性和有效性(NCT02384317)。
(三)C3抑制剂Compstatin
Compstatin作为一种环肽于1996年首次发现,通过结合C3和干扰转化酶形成和裂解C3来抑制补体激活,已经有体外和体内实验证明Compstatin类似物是安全有效的。APL-2是Comstatin的聚乙二醇衍生物。目前有一项II期临床研究APL-2治疗IgAN、狼疮性肾炎、原发性膜性肾病或C3肾小球疾病患者的效果(NCT03453619)。
(四)抗MASP-2的单克隆抗体OMS721
甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2 (MASP-2)是凝集素途径关键成分,靶向MASP-2可以减少肾小球凝集素途径的激活。OMS721是一种抗MASP-2的单克隆抗体。目前有一项I期安慰剂对照双盲随机研究正在招募中,旨在评估OMS721在超过1g/d蛋白尿的IgAN患者中的安全性和有效性(NCT03608033)。
(五)反义抑制剂
反义技术主要是通过干扰基因的解旋、复制、转录,mRNA的剪接加工、输出和翻译等各个环节以调节细胞的生长、分化。第一种反义药物Vitravene在1998年获批用于治疗巨细胞病毒视网膜炎的艾滋病患者。目前已经进行了许多反义药物相关的临床试验,包括用于治疗癌症、病毒感染、自身免疫性疾病和过敏性哮喘等。有研究表明,因子B反义寡核苷酸(ASO)能引起肝脏mRNA和血浆因子B显著降低,有一项尚未开始招募的II期临床试验,旨在评价补体因子B的mRNA反义抑制剂lonis-Fb-LRx的有效性和安全性,并评价lonis-b-LRx对IgAN患者血浆因子B水平面影响(NCTO4014335)。RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解现象,具有特异性剔除或关闭特定基因表达的功能。Cemdisiram (ALN-CC5)作为一种合成RNAi,可以抑制肝脏C5的产生。目前一项II期双盲随机安慰剂对照试验正在招募中,主要是评估Cemdisiram对蛋白尿>1g/d的1gAN患者的安全性和有效性(NCTO3841448)。
(六)补体因子B抑制剂LNP-023
IgAN患者的血清补体因子B水平升高可能与B细胞激活和黏膜免疫有关。目前有一项Ila /Ilb期临床试验正在进行统计分析,针对的是口服小分子可逆因子B抑制剂LNP-023治疗IgAN 90天所引起蛋白尿减少(NCT03373461)。
C3肾小球肾病(C3G)是一种罕见肾脏疾病,患者主要为青年人群,预后较差,存在显著未满足的医学需求。
近期,欧洲药品管理局(EMA)已授予LNP-023 (Iptacopan)治疗C3G的优先药物(PRIME)资格以及治疗IgAN的“孤儿药”资格。
目前,LNP-023正在进行针对多种肾脏疾病[包括C3G、IgAN、aHUS(非典型溶血尿毒症综合征)、iMN(特发性膜性肾病)]的临床试验平行开发以及血液疾病[阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)]临床试验。
根据当前的临床试验结果,LNP-023有望成为一种首创、口服给药、高效、高选择性的补体旁路B因子抑制剂,针对C3G、IgAN等肾脏疾病的根本病因,提供安全有效的治疗药物,满足临床治疗需求。
十、讨论
目前,补体异常在IgAN发病机制方面的研究取得了重大进展,证实了旁路途径的参与及补休成分发挥的重要作用,因此补体水平靶向治疗成为了迫切需求。然而,各补体抑制剂的有效性及安全性尚在临床试验的验证中,有待临床试验提供有力的证据。
参考资料
1、董雪等,IgA肾病机制的研究进展,医学综述,2018,24(11):2187~2195
2、朱厉等,IgA肾病的精准医学研究进展:IgA肾病中补体系统的活化及临床意义,中华医学杂志,2018,98(14):1044~1047
3、谢院生等,IgA肾病的诊治研究进展,中华肾病研究电子杂志,2019,8(1):1~5
4、杨琼琼,IgA肾病诊治相关的生物标志物,中国实用内科杂志,2020,40(7):533~538
5、陈晓雯等,IgA肾病动物模型研究进展,中华肾脏病杂志,2014,30(5):393~395
6、刘建新等,实验性IgA肾病动物模型的研究进展,中药新药与临床药理,2019,30(2):257~263
7、翟亚玲等,补体B因子基因遗传多态性与IgA肾病发病和预后的关联性,中华肾脏病杂志,2013,29(7):487~492
8、杨希等,补体旁路途径及活化在IgA肾病的作用研究进展,中国中西医结合肾病杂志,2017,18(5):448~450
9、陈慧萍等,IgA肾病补体异常的研究进展,海南医学,2020,31(6):780~783
10、黄世雪等,补体活化异常在IgA肾病致病机制中的研究进展,临床肾脏病杂志,2018,18(9):516~520
11、朱林波等,补体系统与IgA肾病,中国医科大学学报,2017,46(12):1133~1137
12、杨柳等,补体活化异常与IgA肾病,肾脏病与透析肾移植杂志,2017,26(3):273~276
13、张岩等,补体在IgA肾病发生发展中的作用,中华肾病研究电子杂志,2019,8(6):269~272
14、刘全等,补体调节蛋白与IgA肾病,中国实用医刊,2013,40(12):122~124
15、祁娇等,补体及免疫球蛋白在原发性IgA肾病中的研究进展,河北医药,2016,38(6):927~931
本文综合整理自南昌弘益药物研发团队,欢迎转发,禁止转载,转发授权请联系0791-88131615.