磷酸二酯酶（PDEs）具有水解细胞内第二信使〔环磷酸腺苷（cAMP）或环磷酸鸟苷（cGMP）〕的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用。cAMP和cGMP对于细胞活动起着重要的调节作用。而其浓度的调节主要由腺苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶水解作用之间的平衡决定。PDEs在人体内分布广泛，生理作用涉及多个研究领域。近年来，PDEs作为新的治疗靶点，引起了众多学者广泛的关注。

PDEs是一系列水解cAMP及cGMP的水解酶，是调节cAMP和cGMP水平的重要环节。cAMP与cGMP是细胞内重要的第二信使，cAMP由腺苷酸环化酶催化三磷酸腺苷形成，其降解由不同的PDEs催化，PDEs能催化水解环磷酸核苷磷酸二酯键。cGMP的降解由相应的具有cGMP活性的PDEs催化。

PDEs超家族的多样性和复杂性为多种疾病的治疗提供了新的线索。必须设法了解PDEs作用的细胞内微环境及这些酶之间的相互影响和作用机制，对PDEs结构及PDEs抑制剂的研究有利于探索同功酶的选择性，因而有利于新型高选择性PDEs抑制剂的研制。

PDEs同工酶分布在不同组织中，具有不同的生理功能。不仅每个PDEs家族有特异性底物和调节特点，而且每个家族各成员间也有组织、细胞、亚细胞特异性表达的不同，参与不同的信号传导通路。选择性PDEs抑制剂可特异性作用于不同的同工酶而发挥不同的作用。所以PDEs成为药物开发很有吸引力的作用靶点。在心血管疾病、生殖系统疾病、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）等诸多领域均涉及到PDEs同工酶家族。

PDEs是一个多基因大家族，开发选择性的PDEs抑制剂将为多种疾病的治疗开辟新的思路。随着分子生物学、生物化学、药理学等的研究发展，PDEs同工酶被细分为若干亚家族及次亚家族，药物可高特异性地作用于PDEs的某个亚家族或次亚家族靶点，可大大提高疗效，减少毒副作用。而且PDEs新的家族成员不断被发现，家族成员之间的差异也逐步达到能够精细的定位，为高选择性PDEs抑制剂的设计提供了坚实的基础，为心血管疾病、自身免疫性疾病、COPD等疾病治疗药物的研发开辟了广阔的前景。

一、磷酸二酯酶基因分型

PDEs是一个多基因的大家族，它包括11型共30余种具有不同底物专一性、不同酶动力学特征、不同调控特点以及不同细胞与亚细胞分布区域的不同的磷酸二酯酶同功酶。PDEs同工酶具有相似的结构，均包含调控和催化两个功能区域。各型PDEs催化区的氨基酸序列75%以上相同，显示出家族成员间的同源性，并决定着对底物或抑制剂的专一性。

PDEs具有不同的底物专一性：PDE4、7、8专一作用于cAMP，而PDE5、6、9则选择性地作用于cGMP。PDE3以相似的亲和力与cAMP和cGMP结合，但相对较不易水解cGMP，因而在功能上被视作对cAMP专一，cGMP通过与酶作用部位的竞争性结合而起负调控因子作用。PDE1和PDE2既能水解cAMP，又能水解cGMP，但PDE1因其亚型不同，对两种底物发挥不同的水解效能。PDEs的氨基端调控区域具有高度异源性，反映PDEs家族成员的不同的辅助因子。此区域是与钙调蛋白（CaM）（PDE1）、非催化的cGMP（PDE2、PDE5、PDE6）和转导子（PDE6）相结合的部位。另外，PDE3和PDE4氨基端部位还包括膜上的靶区域，PDE1、PDE3、PDE4、PDE5包含蛋白激酶磷酸化部位。这些磷酸化部位能够调节催化活性和（或）亚细胞定位底物和辅助因子的恃异性组合使得cAMP和cGMP系统间的交互作用成为可能。在血小板，硝基扩血管类药物或PDE5抑制剂均可使cGMP增加，进而导致PDE3受抑制而继发性地增加cAMP。相反，在肾上腺球粒细胞，心房利钠因子（ANF）使cGMP增加并通过cGMP介导的PDE2活化，抑制cAMP刺激的醛固酮合成。

二、磷酸二酯酶分类

截至目前，在哺乳动物体内鉴定的PDEs亚型共有11个，即PDE1～PDE11。按照对cAMP和cGMP的水解特性，这11个PDE亚型分为三大类：第一类特异性水解cAMP，包括PDE4、PDE7和PDE8；第二类特异性水解 cGMP，包括PDE5、PDE6和PDE9；第三类能够水解cAMP和cGMP，包括PDE1、PDE2、PDE3、PDE10和PDE11。

（一）磷酸二酯酶1（PDE1）

PDE1有3种同功酶：PDE1A、PDE1B和PDE1C，分别由不同的基因编码。PDE1的催化活性是通过两个CaM结合区域来调控的，然而每种同功酶都有其被激活的独特Ca离子阈值。PDE1C可同等地水解cAMP和cGMP，能下调葡萄糖刺激的胰岛素分泌。PDE1A和PDE1B主要水解cGMP。3种PDE1的分布均有其确定的组织和细胞定位。PDE1B主要在脑和淋巴细胞表达，有丝分裂刺激后，其表达增加。目前已知的PDE1抑制剂有Vinpoeetin、Phenothiazine、SCH51866等，但它们缺乏特异性。鉴于PDE1基因的多样性及其可能在Ca离子和核苷酸信号通路发挥交互联系的作用，提示其在治疗中枢神经系统、心血管和免疫系统紊乱中有一定意义。

（二）磷酸二酯酶2（PDE2）

PDE2的3个同工酶PDE2A1、PDEA2和PDEA3都是一个基因编码的产物，但由于各外显子连接的不同，它们的氨基酸存在差异。PDE2显示出不同的组织和亚细胞分布。膜结合的酶存在于脑和心脏．而可溶性的酶则存在于肝脏和血小板。PDE2亦分布于T细胞，当抗原受体结合后，胸腺细胞PDE2活性下调。在胸腺细胞，依细胞内cGMP的浓度的不同，对cAMP代谢的控制可使PDE4转换为PDE2。与此相似，在血小板，PDE2的作用有赖于环核苷酸的浓度：低cAMP浓度时，PDE2的活性依赖于cGMP；高cAMP浓度时，无论cGMP存在与否，PDE2水解cAMP。在心脏，cAMP和cGMP的浓度相互依赖，提示PDE2和PDE3抑制剂可在治疗心绞痛、高血压和心衰中发挥作用。EHNA[erythro-9一（2-hydroxy一3-nonyt j adenine）为中等效能的PDE2选择性抑制剂，也是腺苷脱氨酶的强抑制剂，因此可致腺苷聚集，并经由受体调控cAMP水平。cGMP和腺苷的协同作用也有利于心律失常的治疗。

（三）磷酸二酯酶3（PDE3）

人类PDE3的两种同功酶PDE3A和PDE3B是分别位于染色体12和11上的不同基因的产物。PDE3A和PDE3B的催化区域均包含一互不相同的44个氨基酸插入段。这44个氨基酸的不同不仅使PDE3A和PDE3B相互区分，亦使PDE3的催化部位有别于其它类型的PDEs。PDE3A和PDE3B的mRNA分布于不同的组织和细胞：在血小板、心脏和血管平滑肌富含PDE3A，而PDE3B主要分布在脂肪细胞和T淋巴细胞。许多PDE3抑制剂被视作强效血管扩张剂和兼有抗血小板活性的药物而用于治疗心衰，然而，前瞻性的随机的Milrinone生存评估测试显示：反复口服给予PDE3抑制剂Milrlnone会增加心衰病人的死亡率。故仅少数PDE3抑制剂如Milrinone、Aminone、Enoximone可以急性、短期静脉给药治疗心衰，同时须密切监测病人是否会出现室性心律失常增加的情况。PDE3B抑制剂可调节T淋巴细胞功能，人类T细胞以PDE3和PDE4占优势，PDE3和PDE4抑制剂相互协同，能强有力地抑制T细胞受体介导的细胞因子的产生和有丝分裂的扩增。

（四）磷酸二酯酶4（PDE4）

人类PDE4的同功酶具多样性，分4种亚型：PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D。PDE4与多种炎性细胞的cAMP水解有关，因此，抑制PDE4可抑制免疫和炎症细胞。而且，cAMP介导气道平滑肌松弛。与口服肾上腺素受体激动剂相比，PDE4抑制剂扩张支气管的作用较弱。PDE4抑制剂Rolipram、Denbufylline、CDP840、CP80633、Ro20 1724等可能成为新型抗炎药物。CDP840用于哮喘的治疗。CP80633能减少特异反应性的病人的皮肤病变部位的炎症。选择性PDE4亚型抑制剂的开发将有可能增强疗效而减少不良反应。新型、强效PDE4抑制剂1-pyridy|naph—thalene的一系列衍生物显示出良好的抗哮喘作用且少有呕吐及心血管方面的不良反应。

（五）磷酸二酯酶5（PDE5）

与PDE1和PDE2不同，PDE5绝对专一地水解cGMP，且无同功酶。PDE5包含两个立体异构的cGMP结合位点，串联地排列于蛋白质的氨基端，cGMP与此两位点的结合并不直接影响酶的催化活性，但影响酶被PKA磷酸化的能力。PDE5抑制剂有Zaprinast、Viagm、CSilaenaft1、E4021等。cGMP中介NO介导的内皮松弛和ANF介导的利尿作用。通过抑制PDE5而使胞内cGMP升高将有利于高血压、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病和心绞痛的治疗，且PDE5抑制剂尚有抗血小板聚集和抗血栓活性。此外，PDE5抑制剂能降低肺动脉压力并对心率影响极小，有望成为新型的选择性的肺动脉扩张剂。E-4010是一种选择性的PDE5抑制剂，能够缓解缺氧所致的大鼠肺动脉高压。长期使用E-4010能降低monoer~aline所引发的肺动脉高压大鼠的死亡率。FDA已批准Viagra用于治疗男性阳痿和勃起功能障碍。人海绵体上主要分布有PDE5，还有PDE2和PDE3。研究结果提示阴茎平滑肌也可通过cAMP介导松弛。因此，Viagra尚有可能通过cGMP中介的PDE3抑制而升高cAMP发挥作用。在Viagra的Ⅰ期试验中，有的病人出现视觉蓝绿色错觉，可能是由于视网膜功能的短暂的、可逆性的改变而造成。这主要是因为Viagra、E-4021等对PDE5和PDE6选择性不高所造成。第三代PDE5抑制剂将以PDE5绝对专一性作用为研究方向。

（六）磷酸二酯酶6（PDE6）

PDE6是光感受器细胞进行光转换级联反应过程中重要的酶。它的活性受异三聚体G蛋白的调控。视杆细胞PDE6全酶是一个四聚体蛋白质，它包括α、β两个大催化亚基和两个具有PDE6抑制作用的小γ亚基。在暗反应光感受器，γ亚基有低水平的PDE6活性。遇光后，视色素视紫红质激活视网膜G蛋白（即转导子），使γ亚基发挥抑制PDE6的活性。而且，除了水解cGMP的活性部位，α、β两个催化亚基有高亲和力的非催化cGMP的结台位点，这些非催化位点不直接调控在活性位点的cGMP的催化，而是调控γ亚基对催化亚基的亲和。

（七）磷酸二酯酶7（PDE7）

PDE7A1和PDE7A2是同一基因在表达上不同接合的变型，二者的mRNA均在多种组织中普遍表达。然而，蛋白质的表达则有严格限制，提示PDE7的功能角色使其蛋白质的翻译受到高度调控。在T淋巴细胞中已发现PDE7A1活性和蛋白质。抑制PDE7可能有利于治疗某些免疫功能紊乱。

（八）其他磷酸二酯酶

1、PDE8

PDE8是PDEs家族中cAMP底物特异性同工酶之一，在多种生理过程中起重要作用，并与肾上腺皮质增生等疾病有关。

2、PDE9

人类的PDE9最早在1998年被克隆和测序，是迄今为止报道的对cGMP选择性最高的PDE，是一种cAMP选择性酶。PDE9缺乏与PDE2、PDE5、PDE6相似的cGMP结合的立体异构区域，其与cGMP的结合常数（km）为170nm，而对cAMP的结合常数值高达230000nm，选择性超过1000倍。与PDE2A及PDE5A比较，由于PDE9没有cGMP的结合区域，因此PDE9的催化活性并不会被cGMP增强，所以PDE9抑制剂可能提高基线cGMP浓度。

3、PDE10

PDE10包含两个氨基末端结构域，其类似于PDE2、PDE5和PDE6的cGMP结合域，是贯穿于多种蛋白质的保守结构域。由于此结构域的宽泛和保守，被称为GAF结构域。尽管在PDE2、PDE5和PDE6中，GAF结构域结合cGMP，但这可能不是该结构域的首要功能。PDE10体外研究结果表明，cGMP结合的解离常数远高于9μM。因为不认为cGMP的团内浓度能达到大多数细胞中这么高的水平，其很可能是通过调节增加了cGMP与PDE10的亲合性，或者在PDE10中的FAF结构域的首要功能可能是其它，而并非与cGMP结合。研究显示PDE10在脑区域的神经元中高水平地存在，所述区域的神经元与很多神经和精特疾病相关。通过抑制PDE10的活性，在神经元中cAMP和cGMP的水平提高，由此使这些神经元起作用的能力得以改善。

4、PDE11

人类PDE11有4个亚型，能水解cAMP和cGMP。

三、磷酸二酯酶在组织器官的分布及作用

（一）PDE1分布及作用

PDE1分布于平滑肌、心脏、肺、神经系统、生殖系统等；其作用包括调节平滑肌细胞收缩增殖、调节精子活动、调节免疫细胞功能等。

（二）PDE2分布及作用

PDE2分布于肾上腺、神经系统、平滑肌、巨噬细胞、内皮细胞等；其功能包括调节cGMP和cAMP之间的相互作用、调节肾上腺的分泌作用、调节神经系统活动、心肌钙离子通道活性等。

（三）PDE3分布及作用

PDE3分布于心脏、血管平滑肌、血小板、肾、肝、免疫细胞等；其作用包括:调节心肌收缩力、血小板聚集、血管平滑肌收缩、肾素释放及胰岛素信号转导等。

（四）PDE4分布及作用

PDE4分布于被广泛表达于各种组织内；其作用包括调节脑功能、调节单核细胞及巨噬细胞功能、血管平滑肌细胞增殖等。

（五）PDE5分布及作用

PDE5分布于心脏、血小板、血管平滑肌、脑、肾、肺和骨骼肌；其主要作用包括调节血管收缩，尤其是阴茎和肺部血管的舒缩，同时通过调节NO-cGMP信号系统调节血小板聚集等。

（六）PDE6分布及作用

PDE6分布于视觉系统中；其主要作用在于调节眼部视觉信号的传输。

（七）PDE7分布及作用

PDE7分布于免疫系统、骨骼肌、内皮细胞、神经系统等；主要作用于T细胞的活化及免疫调节方面。

（八）PDE8分布及作用

PDE8分布于睾丸、脾、消化系统、肾、神经系统、心脏等；可调节心肌细胞对β受体激动的反应及T细胞活化等功能。

（九）PDE9分布及作用

PDE9广泛分布于各种组织内，其作用尚鲜为人知，可能与脑组织中的NO-cGMP信号有关。

（十）PDE10分布及作用

PDE10在脑、睾丸、甲状腺等组织中高表达；其功能与调节学习和记忆功能相关。

（十一）PDE11分布及作用

PDE11在骨骼肌、脑、前列腺、睾丸、甲状腺、肾脏、胰腺、淋巴样细胞、垂体、肾上腺、唾液腺及肝脏等组织中表达；其功能可能与精子的发育和功能相关。

四、磷酸二酯酶基本功能

PDEs是一个超级酶家族，人类基因组编码了21个PDE基因，这些基因通过不同的mRNA剪接方式，以及采用不同的翻译起点等调控方式，编码了超过100种PDE变异体蛋白。根据这些蛋白质的序列相似性、酶动力学特征、调节性质、细胞组织分布和药理学性质，它们被分为11个同工酶家族（PDE1～PDE11）。其中，PDE4、PDE7和PDE8选择性水解cAMP；PDE5、PDE6和PDE9选择性水解cGMP；PDE1、PDE2、PDE3、PDE10和PDE11对cAMP和cGMP无选择性。

在PDEs同工酶家族之间各蛋白质的氨基酸序列同源性为40%左右，而在一个同工酶家族内各蛋白质的氨基酸序列同源性约为70%。所有PDE分子C端都有一个约300个氨基酸残基的高度保守的催化结构域。这个催化结构域都含有共同的序列H（X）3H（X）25～35（D/E）（其中X为任意氨基酸），这与金属水解酶家族是相似的。在不同的PDEs家族同工酶之间，蛋白质分子的N端区别很大，而且不同的N端结构城有着不同的调节功能，如PDE1的N端有钙调素结合部位，可通过与钙调素结合而调节酶的话性；PDE2、PDE5、PDE6和PDE10的N-端都有GAF结构城，可通过结合cGMP而变构调节酶活性，并介导PDE单个分子形成有功能的二聚体；PDE8的PAS结构域介导蛋白质与其它蛋白或信号分子的相互作用等。另外，即使是同一个亚家族的PDEs也可能由于mRNA的剪接方式和翻译起始点的不同而造成其在不同的细胞或组织器官中的分布不一样，甚至在细胞内所富集的位置也不一样。

五、磷酸二酯酶家族催化结构域性质和晶体结构

2000年，Xu等发表了第一个PDE家族蛋白催化结构域的原子级别结构PDE4B催化结构域晶体结构。从此以后，大量的文献报道了PDE4催化结构域以及其它PDEs同工酶催化结构域与底物、产物和抑制剂的晶体和核磁共振结构。PDEs家族相关的药物设计也成为研究热点。至今，11个PDEs同工酶家族中，已有多个PDEs家族的催化结构域晶体结构被确定，它们是PDE1B、PDE2A、PDE3B、PDE4B/D、PDE5A、PDE7A、PDE9A和PDE10A等。

（一）磷酸二酯酶家族催化结构域整体结构

目前，已报道的PDEs催化结构域晶体结构均大致相同，都由16个α螺旋构成。这16个α螺旋又可以分为三个子结构域，并形成一个与底物或者抑制剂结合的口袋。这个催化活性口袋包含了在PDEs家族中高度保守的17个氨基酸残基中的11个，说明这11个氨基酸残基对PDEs的催化活性有着至关重要的作用。当底物与三个子结构域相互作用时，这些氨基酸残基的构象可能发生变化，推动催化水解反应。研究表明，通过调节酶活性和速冻的方法获取PDE9催化结构域与底物cAMP、5'-AMP以及催化反应中间体的品体结构，从原子级别揭示了PDE9的催化机理。

（二）金属离子结合位点

在已发现的PDEs催化结构域的催化活性口袋的一端，存在两个金属离子。这两个金属离子参与了对底物cAMP或cGMP的水解反应。其中一个金属离子与两个组氨酸残基和天冬氨酸或天冬酰胺残基配位。从PDE5催化结构域的晶体结构中确认这个金属离子是Zn离子。之后，在其它PDEs同工酶催化结构域的晶体结构中都发现相似的离子，并且与PDEs结合非常紧密，为催化水解反应中不可缺少的一个因素，是PDEs催化结构城的一部分。第二个金属离子与PDEs的结合没有像Zn离子的结合那么紧密，并与多个水分子形成配位键。这个金属离子一般被认为是Mg离子或锰离子。在与金属离子配位的水分子中，有一个水分

子同时与两个金属离子发生配位，量子化学计算结果显示，这个水分子被两个金属离子极化，能部分电离出氢氧根离子，被认为是进攻底物磷原子的亲核分子。

（三）底物cAMP和cGMP的识别

在11种PDEs同工酶家族中有三种特异性识别cAMP为底物（PDE4、PDE7和PDE8），三种特异性识别cGMP为底物（PDE5、PDE6和PDE9），其它五种对两种底物都有相似的催化水解能力。对于为什么PDEs能特异性识别结构仅有微小差别的cAMP/cGMP，一直都是PDEs研究领域的热点。在PDEs的催化活性口袋中有一个谷氨酰胺残基是高度保守的。在PDE4和PDE5的晶体结构中，这个谷氨酰胺残基上酰胺基团的构象相反（N原子和O原子位置交换），其构象通过与蛋白中其它残基侧链形成氢键而被固定住。这个谷氨酰胺残基在cAMP特异性的PDE中与产物形成的氢键与在cGMP特异性的PDE中所形成的氢键数目并不一样。通过比较PDE4和PDE5分别与各自的产物5'-AMP和5'-GMP复合物的晶体结构，有人提出了"Glutamine swichn"机理，认为谷氨酰胺残基的构象决定了PDEs的底物特异性。由这个机理推出，如果此谷氨酰胺残基构象被固定，则对水解底物有选择性，而如果其构象可以自由转变，那么这样的PDEs就对两种底物的催化水解能力相似。但是，在最近对PDE10和PDE4突定体与成物复合物晶体结构的研究结果表明，在PDE10中虽然相应的谷氨酰胺残基的构象被一个酪氨酸残基所固定，但PDE10仍然对cAMP和cGMP都有相似的催化水解能力：PDE10A2能选择性结合syn构象的cAMP和cGMP，而在PDE4D2（D201N，无活性）中却选择性的结合了anti构象的cAMP。所以PDEs家族蛋白的底物选择性是由多种因素所确定的，并且不同的PDEs同工酶家族可能有各自的机理。催化活性口袋中起支撑作用的氨基酸残基种类和口袋的大小形状决定了其对底物的结合能力。在双底物特异性的PDEs同工酶家族中，底物cAMP和cGMP可能以相同或者不同的构象与蛋白质分子结合。而在单一底物特特异性的PDEs同工酶家族中，由于其催化活性位点的环境只能对相应构象的底物有着校高的结合能力，从而使得其选择性水解单一底物。

六、磷酸二酯酶家族蛋白的N端调节结构域功能和晶体结构

PDEs家族蛋白的N端调节结构域的功能各不相同，如参与配体结合、形成多聚体、变构调节酶催化活性、磷酸化/去磷酸化调节酶活性、与其它蛋白质和细胞组分发生相互作用等。如PDE4的抑制剂Rolipram与PDE4催化结构域的结合能力比全长PDE4的结合能力约低100倍。另外，通过水解蛋白质片段和剔除突变等研究方法发现，在有些PDEs同工酶家族中N端结构域对其催化活性有自我抑制作用。研究方现，包括部分PDEs家族N端结构域的一些不同信号传导结构域都能活化细胞内腺苷基环化酶，这说明尽管氨基酸序列不同，但这些信号传导结构域也许存在有相似的活化机理。

GAF结构城广泛存在于不同的蛋白质中，例如转磷酸酶、组氨酸激活酶、磷酸转移酶、环化酶和PDEs中，其作用是通过结合核苷酸等小分子来调节酶活性。在PDEs家族中，PDE2、PDE5、PDE6、PDE10和PDE11都含有GAF结构域。2002年，Marinez S.等人已经解出包含GAF-A和GAF-B结构域的鼠PDE2A的N端蛋白质片段晶体结构。GAF-A和GAF-B之间通过一个螺旋结构连接，这可能是PDE2二聚体界面的组成部分之一。研究报道了PDE2前后被GAF结构域包裹着的结构，这说明在PDE2中GAF-A结构域可能有形成二聚体的作用，而GAF-B结构域的作用是与cGMP结合。单独分离出的GAF结构域与cAMP或cGMP有着很高的结合能力，所以其与cGMP的结合功能使得PDE2在较低的底物浓度下仍然有着很高的环核苷酸催化水解活性。在PDE5的GAF结构域结合了cGMP后，PDE5的催化水解能力提高，KM降低。在其它的PDEs同工酶家族中，GAF结构域也有着类似的作用。

PDE8分子的N端存在有与其它PDEs同工酶家族不同的结构域-PAS结构域。PAS结构域与GAF结构域有着类似的结构，其作用主要是参与蛋白质分子之间的相互作用以及配体的结合。PDE4分子N端的UCR结构域被推测是与酸化磷脂的结合区域，但其具体作用仍需要进一步的研究。

七、磷酸二酯酶家族全长蛋白结构

目前还没有PDEs家族全长蛋白质分子的晶体结构报道，只有PDE6α/β二聚体电子显微镜低分辨率模型。在这些模型中，PDE6的N端结构域被C端的催化结构域间隔开。由于这些模型是在一种条件下不同结构域之间相互作用状态的照片，而在细胞内蛋白质分子是存在于很多不同的外界环境中，因此这种模型是否能正确表征出细胞内PDE6不同结构域之间的相互作用及其真实构象还不是很明确。另外，PDEs家族N端结构域与全长蛋白质分子的酶促反应动力学表征不尽相同，如PDE8A全长蛋白质（包含PAS结构域）的对cAMP催化水解活性约是PDE8A催化结构域片段的5倍。并且当IκBβ与PAS结构域结合后，PDE8A全长蛋白质的催化水解活性又约提高了2倍。因此PDEs全长蛋白的三维结构信息以及催化结构域和调节结构域之间相互作用的信息对了解PDEs作机制及抑制剂设计十分重要。但是目前大量表达以及结晶PDEs全长蛋白是相当困难的。对大多数PDEs而言，N端调节结构域与C端催化结构域之间相互作用的具体信息尚不清楚。

八、磷酸二酯酶家族二聚体结构和磷酸化

尽管在体外PDEs催化结构域片段的单体蛋白仍有催化活性，但在细胞内PDEs家族都可能通过N端域或C端结构域形成二聚体或者多聚体。而PDEs家族的催化结构域之间的相互作用可能不足以稳定形成全长蛋白质分子的二聚体结构。所以蛋白质分子N端结构域对PDEs家族的二聚体稳定性有重要作用。例如,通过不同纯化方法从脑组织中提取的PDE1为同型二聚体，而且能经过蛋白质水解剪切为仍然保持催化活性、分子量为36kDa的PDE1催化结构域单体。从牛肾上腺和其它组织中纯化出的PDE2为200～230kDa的二聚体，而其单体分子量应该为120 kDa。对PDE2A的GAF结构域晶体结构的研究表明，PDE2能通过GAF结构域形成二聚体。在PDEs家族中GAF结构域广泛存在并具有较大的同源性，通过剪切和突变实验的研究发现，在PDE5、PDE6、PDE10和PDE11中，GAF结构域也能形成二聚体结构。虽然在PDE4中并没有GAF结构域，但高度保守的UCR结构域可能有着与其类似的作用。而其它PDEs家族同工酶PDE3、PDE7、PDE8和PDE9都还没有确定的实验数据来证明它们能形成二聚体或者多聚体结构。

虽然对PDEs家族蛋白质分子能形成多聚体的原因还未明确，但其多聚体结构被拆散后也就失去了其对催化活性调节的功能。例如，磷酸化后的PDE4D3单体的催化活性与多聚体相比有所降低。没有UCR结构域的短型PDE4只能形成单体，并且不能被PKA激活。研究报道，当二聚体结构被拆散后，某些PDEs家族的催化结构域与抑制剂的结合能力将有较大的变化。

已知在PDE1、PDE3、PDE4、PDE5和PDE10等PDEs同工酶家族中存在磷酸化位点。这些位点的磷酸化/去磷酸化调节着PDEs蛋白的催化活性，以及它们与其它蛋白或细胞组分的相互作用。当PDE1的N端结构域被PKA或者CaM-kinasell磷酸化后，它与钙调节素的结合和被激活的能力降低。以PKA为介质对PDE4D3中一个丝氨酸残基的磷酸化增加了PDE4D3对底物cAMP的Vmax和它与Mg离子的结合能力，从而增加了酶的催化水解活性。有研究报道在PDE4的4个子家族中都有相同的磷酸化位点。PDE4被磷酸化后，其与抑制剂Rolipram的结合能力也有很大的提高。

 

九、磷酸二酯酶家族催化水解反应机理

近来多个PDEs家族催化结构域晶体结构的发表，使得人们得以从原子级别上推测PDEs催化水解cAMP和cGMP的机理。这些晶体结构中有些是催化结构域与产物的复合物；有些是在突变后失去活性的情况下催化结构域与底物的复合物。有研究报道了通过快速冷冻获取和在用不同金属离子浓度调节PDE9活性的条件下得到了PDE9催化结构域与cAMP和cGMP的晶体结构，这些晶体结构直接揭示了底物和水解产物是如何与PDE分子相结合的。有研究通过量子计算认为同时与两个金属离子都形成氢键的水分子是作为进攻底物上磷原子的亲核试剂。综合已知的晶体结构研究，有研究者提出这个桥接两金属离子的水分子与邻近的天冬氨酸残基协同进行亲核进攻。在PDEs家族中，与金属离子配位的组氨酸的绝对保守性以及产物与不同PDEs同工酶有着相近的结合方式，说明了在PDEs家族不同同工酶之间，其催化水解机理可能极其相似。

十、磷酸二酯酶家族催化结构域与药物设计

设计和研究对不同PDEs同工酶家族有选择性的抑制剂是PDEs研究领域的一个重点。以PDEs为目标蛋白的药物常有强心、松弛平滑肌、抗血栓、平喘、血管扩张和消炎等方面的作用。PDE5的抑制剂Sidenafil（Vigra）、Vandenail（Levitae）和Tadalafil（Cialis）都被成功地应用在治疗男性勃起功能障碍方面。近来，又发现这些药物能治疗肺动脉高压。PDE4特异性抑制剂有可能作为治疗哮喘和慢性阻塞性肺疾病的药物；PDE3特异性的抑制剂被证明能治疗间歌性跛行。但是目前大多散PDEs抑制剂的副作用问题仍然是妨碍它们临床应用的最大障碍。根据PDEs催化结构域高分辨率的三维结构设计具有高选择性PDEs抑制剂是目前研究的一个热点。

十一、蛋白质的复性

为了满足对潜在蛋白质受体的筛选和蛋白质晶体结构研究的快速发展需要，三类重组表达系统被发展为特异性的大量表达水溶性目标蛋白质：细菌、昆虫细或酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞表达体系与人体内细胞转录后的修饰体最接近，大多数蛋白质能通过这种表达体系重组表达得到正确折叠的水溶性蛋白质。但是，在哺乳动物细胞内，外源蛋白质的表达产率很低，成本过高。昆虫细胞和酵母细胞表达体系相对哺乳动物细胞表达体系来说成本较低，产率较高，

但其转录后的修饰系统，如糖基化，与人体内有很大的差异。细菌表达体系为所有表达体系中表达成本最低、产率最高的，而其简单的蛋白质折叠系统和缺乏转录的修饰使得重组表达出的蛋白质分子没有经过修饰，并且常常是不水溶的或生物活性较低。即使如此，大肠杆菌（E.coli）等细菌表达体系仍为应用得最广泛的重组蛋白质表达体系。

虽然在E.coli内能大量且低成本地表达重组蛋白质，但大部分高表达量的重组蛋白质为不水溶状态，并聚集为包涵体的形式存在。这样得到的蛋白质没有生物活性，无法应用到蛋白质结构和生理活性的研究中。因此对包涵体内蛋白质的复性研究已经成为蛋白质结构和性质研究的一个重要方向。以包涵体形式表达出的不同重组蛋白质的复性过程也不一样，其条件和方法可能相差甚远。越来越多的重组蛋白质从包涵体中提取，并成功复性为天然状态。目前已有至少238个家族中738种蛋白质的复性条件和过程被保存在REFOLD数据库中。

以包涵体形式表达出的重组蛋白质一般先从细胞内分离出来，通过高浓度的变性剂溶解后，如含有8M尿素和6M盐酸胍的缓冲液，经过简单的纯化过程即能得到含有高浓度变性蛋白质的溶液。此时蛋白质溶解在变性剂中，处于去折叠状态，并没有生物活性。在获得变性蛋白质溶液后，应用各种技术手段除去溶液中的变性剂让蛋白质再折叠为天然状态。但是蛋白质的再折叠反应是通过一系列的中间体最后折叠为天然状态，在此过程中蛋白质折叠和聚集反应相竞争。在实验中，往往最后得到的是聚沉的蛋白质，复性成功率并不高。如何降低折叠反应速率和抑制聚集反应是蛋白质再折叠成功的关键。到目前为止，在REFOLD数据库中已有至少35种技术方法被应用到蛋白质的再折叠研究中。其中40%成功蛋白质再折叠实验是通过直接稀释方法实现的，其次是透析方法，约有27%。超滤、柱层析和分子伴侣协助折叠等其它方法也有成功的应用实例。蛋白质再折叠的反应环境对再折叠效率有着重要的影响，如溶液的pH值、氧化还原剂的浓度、各种添加剂的浓度、反应温度和时间等。需要再折叠的蛋白质自身性质，如是否有配体小分子、等电点和二硫键数目等，对再折叠有一定的指导意义。目前能成功复性的蛋白质分子量多在10～60kDa内。

用直接稀释的方法对蛋白质进行复性有着简单、易操作、成本低廉和蛋白质用量较小等优点，但其最终溶液体积过大，给接下来的纯化和富集蛋白质操作带来了困难。通过稀释的方法进行蛋白质复性时，变性蛋白质的浓度一般为几十到几百微克每毫升，以防止蛋白质浓度过高导致大量蛋白质聚集。透析的蛋白质复性方法同样也有此缺点。近年来发展的色谱柱层析等固相辅助复性方法有着快速、可自动化和可结合纯化等优点。

PDEs家族中，PDE3B、PDE4A和PDE7A的催化结构域已用直接稀释的方法成功复性。其中由复性得到的PDE3B催化结构域蛋白质用于结晶并得到晶体结构。

十二、磷酸二酯酶抑制剂

PDEs抑制剂是一种以抑制磷酸二酯酶活性的药物，选择性的PDE3、PDE4、PDE5抑制剂在心衰、哮喘、阳痿等疾病中具有广泛的应用。通过抑制使cAMP裂解的磷酸二酯酶F-Ⅲ，抑制cAMP的裂解，而升高细胞内cAMP的浓度，增加钙离子内流，产生正性肌力的作用，除了正性肌力作用外，PDEs抑制剂还通过增高血管平滑肌细胞内cAMP的含量而具有扩血管的作用。

（一）磷酸二酯酶作用机制分析

cAMP和cGMP是细胞内两种重要的第二信使，通过特殊的受体参与机体的多种新陈代谢活动，其细胞内浓度的调节主要由腺（鸟）苷酸环化酶的合成和磷酸二酯酶（PDEs）的水解作用之间的平衡决定。PDEs能特异性地以3,5-环核苷酸为底物，催化细胞内的cGMP和cAMP水解生成相应的无活性的5-核苷酸,从而影响生物体的各种代谢功能。

（二）磷酸二酯抑制剂作用机制

cAMP和cGMP作为神经递质、激素、光和气味等物质的第二信使，广泛作用于细胞内靶器官，如：激酶、离子通道及各种PDEs。当外来信号经跨膜传递并引起一系列生理反应使核苷酸环化酶激活后，cAMP和cGMP产生，PDEs家族的使命便是使之水解失活为5-单磷酸核苷（AMP）。核苷酸环化酶的合成和PDEs水解失活之间的平衡决定了第二信使cAMP和cGMP的浓度。值得注意的是，cGMP不但被PDEs水解，而且能调节一些PDEs活性，如PDE2可被cGMP刺激，而PDE3可被cGMP抑制，PDE4对cGMP不敏感。

PDE4抑制剂的抗炎作用机制主要涉及：抑制多种炎症介质/细胞因子的释放，能够抑制TH2细胞IL-4、IL-5基因的表达；抑制白细胞的激活（呼吸爆发），抑制白细胞游走；抑制细胞粘附因子（CAM）的表达或上调；诱导产生具有抑制活性的细胞因子，如IL-6；诱导细胞凋亡；刺激内源性激素和儿茶酚胺类物质的释放。

PDE5抑制剂用于勃起功能障碍的作用机制：阴茎勃起的机制很复杂，目前尚无统一认识。现在多数研究者已将注意力从血流动力学转向神经介质。已证实有三种神经机制共同参与海绵体平滑肌和螺旋动脉张力调控。即肾上腺素能、胆碱能和非肾上腺素能非胆碱能（NANC）。现在认为NANC机制是海绵体血管、平滑肌舒张的主要机制，而NO为NANC的神经介质。在整个勃起生理过程中，阴茎血管及海绵体平滑肌舒张是关键因素。sildenafil通过NO/cGMP通路而发挥作用。在盆腔神经NANC神经系统刺激下，NO合酶（NOS）作用于L-精氨酸的胍基氮末端产生NO，由于其亲脂性，可透过细胞膜在邻近细胞间迅速扩散，并作用于细胞中的鸟苷酸环化酶（GC），与其亚铁血红素分子中的铁离子结合，形成NO-GC复合物。这种复合物与该酶的卟啉部位相结合，导致构型的改变而激活GC，使细胞中cGMP大量产生，cGMP作为细胞内第二信使，可产生一系列生理反应，使海绵体平滑肌及血管舒张。cGMP传递信息的同时被PDE5水解转化为5-GMP而失活。sildenafil选择性抑制PDE5对cGMP水解，从而使cGMP积聚性浓度提高，大大增强了其血管舒张效果。

（三）PDE1及其抑制剂

PDE1是最早发现的PDEs同工酶之一，对cAMP与cGMP均有水解作用。PDE1A与PDE1B对cGMP水解能力较强，而PDE1C对cAMP与cGMP水解能力无明显差异。PDE1A主要分布于血管平滑肌细胞中，可调节平滑肌的紧张性，PDE1B主要分布于神经系统中，参与学习记忆、免疫调节等生理活动，而PDE1C主要分布于大脑和平滑肌细胞中，可能参与了血管平滑肌细胞的增殖以及中枢神经系统的信号传递。PDE1主要通过与Ca2+/CaM绑定发挥作用，绑定后的PDE1含有两个催化亚基和两个钙调蛋白分子组成，在第二信使环核苷酸单磷酸与Ca2+之间起到连接的作用，如嗅觉信号终止过程中气味分子与嗅觉受体结合后，通过嗅觉特异性通道Gs蛋白激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP升高，cAMP作用于嗅觉特异的环核苷酸门控离子通道后使得细胞内的Ca2+浓度升高，随后激活Ca2+调控的氯离子通道，形成氯离子电流，从而产生特定的嗅觉。而PDE1可以特异性水解cAMP，使得细胞内的Ca2+浓度降低，从而终止嗅觉信号的传递。

到目前为止，已发现的PDE1选择性抑制剂主要有尼莫地平、长春西汀、IC86340及IC224等。Patyar等认为长春西汀具有抗炎作用，可改善内皮功能紊乱以及动脉粥样硬化，并降低脑中风的几率；同时，长春西汀在改善认知功能障碍方面也起到一定的作用。目前，该药已在临床上用于治疗帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病。有报道指出，应用Ca2+通道拮抗剂尼莫地平可以明显降低动脉瘤蛛网膜下腔出血病人的脑动脉痉挛的频率，改善脑局部缺血，从而起到预防脑部再次出血和延缓脑局部再缺血的发生。Jeon等指出，IC86340和长春西汀可以通过调节β-链蛋白信号通路来促进血管平滑肌细胞的增殖。

（四）PDE2及其抑制剂

PDE2对cAMP与cGMP均有水解作用，且PDE2与cGMP绑定后可增强其对cAMP的水解能力。由于起始密码子的不同，PDE2A包含3种亚型：PDE2A1、PDE2A2和PDE2A3。PDE2在许多组织和细胞中都有表达，如中枢神经系统、血小板、心肌细胞、内皮细胞中等。其中PDE2A1主要存在于细胞基质中，而PDE2A2与PDE2A3存在于细胞膜上。由于PDE2与cGMP结合后可以进一步诱导水解cAMP，PDE2可能参与了体内cAMP与cGMP信号交集部分通路调节。另外，PDE2在调节心肌收缩、改善认知功能以及长期记忆方面都发挥着重要的作用。

目前，PDE2抑制剂主要有EHNA、BAY60-7750、IC933和双嘧达莫等。有报道称，EHNA通过抑制PDE活性，可以抑制恶性黑色素瘤细胞DNA合成，使肿瘤细胞周期停留在G2/M期。此外，经EHNA治疗的细胞周期蛋白A的mRNA表达降低，而S期调控蛋白细胞周期蛋白E的mRNA的表达升高，从而影响恶性黑色素瘤细胞周期进程，为临床治疗恶性黑色素瘤提供了新的可能。研究证实，在未添加外源性细胞因子的情况下，EHNA可以抑制胚胎干细胞神经元分化和自发性分化，表明EHNA在抑制组织胚胎干细胞的分化和维持其多能性中也具有重要的作用；双嘧达莫具有抗血小板凝集的功能，用于治疗缺血性心脑血管疾病；BAY-60-7550可以调节NO/cGMP信号通路，从而改善AD病人和脑老化病人的认知和长期记忆功能。相比较PDE1抑制剂，PDE2选择性抑制剂的作用机制已经较为明确，为改善学习和认知功能提供了很好的治疗途径。

（五）PDE3及其抑制剂

PDE3对cAMP与cGMP均有水解能力，但对于cAMP的水解能力约为cGMP的10倍。PDE3有两种基因亚型：PDE3A与PDE3B，分别位于染色体11与12上，由于起始密码子的不同，PDE3A又可分为PDE3A1、PDE3A2和PDE3A3三种亚型，主要分布于心脏、血小板、血管平滑肌及卵母细胞中，具有调节心肌收缩力、血小板聚集、血管平滑肌收缩、卵母细胞成熟及肾素释放等作用。PDE3B只有一种亚型PDE3B1，主要分布于脂肪细胞、肝细胞、精母细胞以及胰腺中，主要参与调节胰岛素、胰岛素样生长因子以及瘦素的信号传导，在肥胖和糖尿病等代谢性疾病中发挥着重要的作用。PDE3选择性抑制剂主要有西洛他唑、西洛酰胺、米力农、氨力农、依诺昔酮和氰胍佐旦等。研究表明，氨力农可抑制PDE3活性，提高心肌细胞内cAMP的浓度，升高细胞内Ca2+浓度，从而充分发挥正性肌力作用。同时，氨力农可直接作用于血管平滑肌细胞，具有良好的扩张血管作用，增加心肌收缩力，降低肺动脉压力，恢复心肺功能，在慢性肺心病合并心力衰竭的治疗中具有重要的价值。此外，西洛他唑临床上用于抗血小板聚集、肺动脉高压（PAH）、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）、间歇性跛行以及脑微血管疾病的治疗。

（六）PDE4及其抑制剂

PDE4对cAMP具有高度特异性，有4种亚型：PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D，每个PDE4基因都有多个转录单位和启动子，PDE4约有20个同功酶，广泛分布于人体各种组织和细胞中，如大脑、肾脏、心肌细胞、内皮细胞和免疫细胞中。PDE4参与了促进单核细胞与巨噬细胞活化、中性粒细胞浸润、血管平滑肌的增殖、血管扩张以及心肌收缩等相关生理病理过程，对中枢神经系统功能、心血管功能、炎症/免疫系统、细胞黏附等都有影响。

目前，对PDE4的研究主要集中在免疫及炎症相关疾病中，世界上许多著名的制药公司都把PDE4作为慢性炎症相关疾病的靶点。PDE4抑制剂发挥抗炎作用主要通过以下几种途径：

1、抑制多种炎症介质的活性；

2、抑制细胞黏附因子的上调和表达；

3、抑制血白细胞的活化；

4、诱导细胞凋亡；

5、诱导具有抑制活性的细胞因子的生成（如白细胞介素-6）；

6、诱导儿茶酚胺类物质和内源性激素的释放。

第一代PDE4抑制剂主要有茶碱、咯利普兰和吡拉米司特等，咯利普兰对神经系统疾病，如PD、抑郁症和焦虑症等都具有一定的治疗价值。但第一代PDE4抑制剂由于严重的恶心、呕吐等副作用，在临床上的应用受到了限制；第二代PDE4抑制剂有罗氟司特和西洛司特等，其中罗氟司特已经通过了FDA和欧盟药品管理局的批准，用于COPD的治疗。此外，罗氟司特对于其他炎症性疾病也有一定的治疗效果，如溃疡性结肠炎和克罗恩病。第三代PDE4抑制剂阿普斯特已经用于自身免疫性疾病如银屑病的治疗，且副作用更小，病人更易耐受。

（七）PDE5及其抑制剂

PDE5可以特异性水解cGMP，只有1种亚型PDE5A，由于起始密码子的不同，PDE5A又可分为：PDE5A1、PDE5A2和PDE5A3。PDE5主要分布于肺、胰腺、大脑、阴茎海绵体、血管平滑肌细胞、血小板、骨骼肌细胞以及心肌细胞中。PDE5可以很好地调节血管平滑肌的收缩力，尤其是阴茎和肺部血管平滑肌的收缩力，PDE5也可通过NO-cGMP信号传递途径参与血小板的聚集，同时PDE5也可能在大脑内cGMP信号传递上起到重要的作用。

PDE5的选择性抑制剂主要有西地那非、伐地那非、他达那非、敏喘宁和乌地那非等。西地那非不仅在治疗男性勃起功能障碍（ED）上取得了巨大的成功，也可用于治疗PAH，改善病人的呼吸困难。Yanagisawa等报道称，通过对PAH病人7年的跟踪研究，发现西地那非作为PAH的一线用药，可以明显提高患者的存活率并改善其生存质量。也有研究证明，PAH病人每天服用他达那非40mg，生活质量得到改善，病情恶化得以减缓。此外，近些年来，研究人员也对PDE5抑制剂在抗癌方面展开了积极的研究，Tinsley等研究表明，西地那非可能参与了硫化舒林酸选择性抑制乳腺癌细胞的生长和诱导癌细胞凋亡的过程。

（八）PDE7及其抑制剂

PDE7家族的生物学功能与PDE4相似，对cAMP具有高度的选择性，作为新的慢性炎症的治疗靶点受到了越来越多的关注。PDE7家族共有2种亚型，PDE7A和PDE7B，二者基因序列同源性高达70%。其中，PDE7A包括3种亚型：PDE7A1、PDE7A2和PDE7A3。PDE7A主要分布于大脑、脾脏、肺部、胸腺以及各种淋巴细胞中，特别是在巨噬细胞和T淋巴细胞中高度表达。PDE7B也有3种亚型：PDE7B1、PDE7B2和PDE7B3。PDE7B主要存在于心脏、大脑、肺、肾、肝、睾丸和肌肉组织中。

目前发现的PDE7选择性抑制剂有BRL-50481和IC242以及基于计算机模拟发现的喹唑啉类和噻二唑类小分子化合物S14和VP1.15等。BRL-50481可以下调慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中PDE7B蛋白的表，升高cAMP含量，从而诱导CLL细胞凋亡。此外，BRL-50481联合其它抑制剂使用时，可增强其它PDE抑制剂的效果，如BRL-50481单独作用于CD8+T淋巴细胞、单核细胞、肺巨噬细胞后，CD8+T淋巴细胞增殖无明显变化， 单核细胞和肺巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF-α）生成仅降低2%～11% ，但可明显增强PDE4抑制剂咯利普兰对以上3种细胞株增殖的抑制作用，并明显降低TNF-α生成，从而增强其抗炎作用。新发现的S14、VP1.15的IC₅₀分别为5.5和1.1 μmol·L^－1，它们可以通过抑制PDE7活性来提高胞内cAMP的浓度起到抗炎的作用，从而有效减少小鼠因炎症反应引起的脊髓损伤的二次损伤。

由于目前对其它PDE家族成员，PDE6、PDE8、PDE9和11的研究尚不深入，报道较少，在此不作深入阐释。PDE6存在于视网膜杆状细胞中，特异性水解cGMP，可能在治疗遗传性色盲、视网膜色素变性等疾病方面存在重要作用；PDE8可以特异性水解cAMP，可能参与了调节心室肌细胞兴奋收缩偶联等生理活动；PDE9可特异性水解cGMP，可以改善记忆和认知功能；近些年来有报道称PDE10可能参与了肺动脉血管重塑的过程，可作为PAH治疗的潜在靶点；Libé等报道，PDE11A可能与睾丸和肾上腺肿瘤的发生存在一定关联，目前PDE11尚无特异性抑制剂。

十三、选择性PDE3/4抑制剂用于治疗慢性阻塞性肺部疾病

COPD最为明显的一个特征就是慢性炎症反应，通常涉及复杂的炎症过程，包括各种炎症细胞，如上皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，以及炎症细胞释放的各种炎症介质和趋化因子。炎症变化和蛋白酶水解失衡可导致肺功能迅速下降。肺内炎症反应增强以及炎症介质和酶水平进一步升高，导致气道阻塞，疾病加重。这些炎症细胞还释放蛋白酶，例如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMP），它们可能直接导致肺损伤，如肺气肿和黏液分泌过多等。因此，对COPD的最为关键的抗炎治疗已经成为研发的重点。

基于非选择性磷酸二酯酶抑制剂黄嘌呤类化合物的临床疗效，各种PDEs抑制剂已被开发用于COPD的炎症治疗。目前，PDEs抑制剂中仅有罗氟司特被批准用于治疗COPD，但由于剂量依赖的不良反应，限制了该药的临床广泛应用。

尽管还有许多PDEs抑制剂已被开发用于治疗COPD，并且它们潜在的抗炎治疗作用已在各种哮喘动物模型中得到证实，但迄今为止除茶碱外，还没有一个PDEs抑制剂被批准用于哮喘的治疗。

鉴于单独应用PDE3或者PDE4抑制剂的局限性，PDE3/4的双重抑制似乎是一种更有吸引力的方式来靶向治疗COPD和哮喘的关键病理特征。目前已有证据显示双靶点PDE3/4抑制剂具有协同抑制效应，包括协同抗炎和支气管扩张作用。在人肺泡巨噬细胞的研究中，Milara等发现单独应用PDE3或PDE4抑制剂仅能抑制约20%的脂多糖（LPS）诱导的细胞因子释放，而联合抑制PDE3/4能有效抑制约90%的LPS诱导的细胞因子释放。在上皮细胞方面，Wright等研究发现rolipam仅部分抑制IL-1β诱发的人气道上皮细胞和A549细胞释放粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），而双靶点PDE3/4抑制剂ORG-9035能完全抑制这一作用。另有研究发现，单独使用PDE3或PDEA抑制剂对松弛支气管肌固有张力是无效的，但联合使用可以有效地放松支气管肌固有张力。此外，单独抑制PDE3或PDE4对致敏原或LTC4诱导的人气道平滑肌收缩无抑制作用，但二者联合作用时具有协同抑制收缩的作用。另外，PDE3和PDE4抑制剂都被证明能激活囊性纤维化跨膜传导调节（CFTR）介导的氯离子分泌，从而增强了黏液纤毛清除，显示出了额外的益处。因此开发对PDE3和PDEA具有双重抑制活性的药物，以便在同一分子中获得抗炎和支气管扩张活性，对于COPD和哮喘等呼吸系统疾病的未来治疗具有重要意义。

（一）处于临床研究阶段的PDE3/4抑制剂

到目前为止，至少有4个处于临床研究阶段的PDE3/4抑制剂，它们是zardavertrine、benzafentrine、pumafentrine和ensifentrine，其中，ensifentrine显示了较好的治疗效果和研究前景。

（二）处于临床前研究的PDE3/4抑制剂

目前有关PDE3/4抑制剂的大多数数据来自临床前研究，有很多研究者报道了具有PDE3/4双靶点抑制活性的化合物的临床前研究结果，包括合成与构效关系等数据。这些PDE3/4抑制剂化合物主要有咪唑并［1，2-a］吡嗪/喹喔啉类衍生物、顺式四氢邻苯二嗪酮/哒嗪类衍生物和稠合双环杂芳族二氢吡啶酮类衍生物等。

（三）展望

鉴于单独使用选择性PDE3或PDE4抑制剂不良反应明显，在临床上的疗效有限，因此联合抑制PDE3和PDE4似乎是治疗COPD和哮喘等炎症性气道疾病的一种有吸引力的策略。越来越多的实验已经证实双靶点PDE3/4抑制剂具有广泛的抗炎和支气管扩张、抗气道重塑以及刺激黏膜纤毛清除的潜力，同时抑制PDE3和PDE4能最佳地抑制参与COPD和哮喘发病机制和吸入途径的某些关键炎症细胞类型的活性。PDE3/4抑制剂研究策略包括：

1、改善口服给药的剂量限制性不良反应，提高吸入给药的活性水平；

2、平衡两个作用靶点的活性水平，尽量避免当其中一个靶点活性水平还未或已经达到预期药效时，另一个靶点活性就已经达到产生毒性反应的水平；

3、有意识提高各个亚型选择性，降低亚型选择性不足所带来的不良反应风险。

因此，尽管已有有效的疗法可用于COPD和哮喘等呼吸系统疾病的治疗，但许多患者的疾病症状仍未得到充分控制，开发可满足这些未满足需求的药物仍有大量的需求。设计可以从全身循环中迅速清除的亚型选择性的吸入性PDE3/4双靶点抑制剂成为目前PDEs抑制剂研究的主流方向，但目前尚无此类药物投入市场，且只有很少一部分PDE3/4双靶点抑制剂进入临床试验。Ensifentrine是唯一一个已经成功通过II期临床试验的PDE3/4双靶点抑制剂，III期临床试验正在进行中。该药在前期临床试验显示出的较好的有效性和安全性的潜力为此类药物的后续研发带来了新的希望。然而，目前此类药物的研发仍然存在一个关键的问题亟待解决，即从疗效的角度来开发具有协同作用的PDE3/4抑制剂，是否可以不需要观察协同作用在潜在不良反应方面的影响?

总之，越来越多的证据已经表明，PDE3/4双靶点抑制剂对参与炎症和支气管扩张的细胞具有附加或协同作用，而对每一单独使用PDE选择性抑制剂可达到的效果有所不同。此外，ensifentrine与毒蕈碱受体拮抗剂在气道舒张方面显示出协同作用，这表明PDE3/4双靶点抑制剂与现有的其他药物联合使用可能比单独使用这些药物更有临床疗效，这些积极的研究结果为PDE3/4双靶点抑制剂的进一步开发和应用提供了更多的可能，受到了研究者的广泛关注，这类药物未来有望成为治疗呼吸系统疾病的一类新型药物。