去泛素化酶及其抑制剂研究综述
发布时间:2021-03-05 11:28:45 | 来源:【药物研发团队 2021-3-5】
泛素是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白,催化机体内一系列反应的发生。
泛素化是指泛素在一系列特殊的酶作用下,将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子,并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。泛素化对蛋白质的定位、代谢、调节和降解起着十分重要的作用。
泛素化修饰广泛存在于真核生物,通过26S蛋白酶体降解途径或信号传递等,改变蛋白质稳定性、定位和活性等功能,参与细胞的周期、转录、炎症、肿瘤和免疫等各项功能,是一类复杂的动态调控系统。
泛素化调节是一个可逆过程,被泛素连接酶(E3)和去泛素化酶拮抗调控。如同其他的翻译后修饰,泛素化是可逆的,可以被一大群蛋白酶逆转,这些蛋白酶称为去泛素化酶(DUB)。大部分的去泛素化酶可以把泛素从底物蛋白分解释放出来,编辑泛素链和处理泛素前提体,有一些去泛素酶和相关的酶与编辑或处理泛素样蛋白以及结合蛋白有关。常见的例子就是SUMO-特异性蛋白酶(SENP),这个酶可以处理SUMO前体和SUMO结合蛋白。
泛素连接酶(E3)与去泛素化酶(DUB)主导的蛋白质的泛素化修饰和去泛素化修饰的动态平衡决定了蛋白质的质量水平、亚细胞精确定位以及与其他蛋白质的相互作用,影响细胞信号转导的正常进行。蛋白质泛素化修饰及蛋白酶体介导的蛋白质降解在蛋白质稳态调控中发挥重要作用,蛋白质异常降解与肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫疾病、骨骼疾病等人类疾病的发生发展密切相关。
去泛素化是泛素化的逆过程。去泛素化是指泛素化的蛋白质在特异性水解酶(去泛素化酶)的作用下解离泛素分子的过程。去泛素化酶是参与蛋白质调节的重要机制,在转录水平、翻译后修饰、蛋白质定位和蛋白质相互作用、信号转导、染色质重塑等方面参与调节细胞内蛋白质功能,参与肿瘤等多种疾病的进程,是肿瘤等疾病治疗药物的重要靶点,已有多个小分子抑制剂用于抗肿瘤等疾病治疗的研发,为临床治疗相关疾病提供新的治疗靶标和诊断指标,成为肿瘤等疾病治疗药物研发的一个重要方向。
一、泛素
泛素是一种存在于所有真核生物(大部分真核细胞)中的小蛋白,催化机体内一系列反应的发生。
(一)泛素的基本结构和功能
泛素由76个氨基酸组成,分子量大约8.451kDa。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质,使其被26S蛋白酶体降解。26S蛋白酶体上调节亚基上的一些受体可以识别K48和K11位连接的多聚泛素化蛋白,20S核心亚基在ATPase供能下水解底物。泛素也可以标记跨膜蛋白,参与蛋白质的膜泡运输。非典型泛素链在细胞信号传导,内吞,以及DNA损伤修复,调控NF-κB通路中起着重要作用。它在真核生物中具有高度保守性,人类和酵母的泛素有96%的相似性。泛素间可以通过酶促反应相互连接,进而介导靶蛋白降解。
(二)泛素催化的化学反应
泛素催化一系列化学反应的发生,整个过程被称为泛素化信号通路。在第一步反应中,泛素激活酶(又被称为E1)水解ATP并将一个泛素分子腺苷酸化。接着,泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上,并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。被腺苷酸化的泛素分子接着被转移到第二个酶,泛素结合酶(E2)的半胱氨酸残基上。最后,高度保守的泛素连接酶(E3)家族中的一员(根据底物蛋白质的不同而不同)识别特定的需要被泛素化的靶蛋白,并催化泛素分子从E2上转移到靶蛋白上。通常认为,靶蛋白在被26S蛋白酶体识别之前,必须被标记上至少四个泛素单体形成的K48位或者K11位连接的多聚泛素链,但也有研究表明两个泛素单体形成的泛素链更能有效地被蛋白酶体降解。一般而言,是E3使得这一系统具有了底物特异性,而E2或者E2-E3决定底物上泛素链的类型。E1、E2和E3蛋白的数量依赖于生物体和细胞类型,人体中就存在大量不同的E3蛋白,这说明泛素-蛋白酶体系统可以作用于数量巨大的靶蛋白。
多泛素化后的蛋白质是如何被蛋白酶体所识别的,还没有完全弄清。泛素受体蛋白的N末端具有一个类泛素结构域,以及一至多个泛素结合结构域。类泛素结构域可以被19S调节颗粒所识别,而泛素结合结构域可以通过形成三螺旋束来结合泛素。这些受体蛋白可能能够结合多泛素化的蛋白质并将其携带到蛋白酶体,而关于这种结合的特异性和调控机制还不清楚。最终,被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
2004年,阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科、欧文·罗斯因发现了泛素调解的蛋白质降解过程而获得了诺贝尔化学奖。
二、泛素化/去泛素化
泛素化是指泛素(一类低分子量的蛋白质)分子在一系列特殊的酶作用下,将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子,并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这些特殊的酶包括泛素激活酶、结合酶、连结酶和降解酶等。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时,它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。泛素化与肿瘤、心血管等疾病的发病密切相关。因此,作为近年来生物化学研究的一个重大成果,它已然成为研究、开发新药物的新靶点。
(一)泛素化过程
泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应:首先在ATP供能的情况下酶E1粘附在泛素分子尾部的Cys残基上激活泛素,接着E1将激活的泛素分子转移到E2酶上,随后E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白,对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例可以将靶蛋白单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。E3酶的外形就像一个夹子,靶蛋白连接在中间的空隙内。酶的左侧结构域决定靶蛋白的特异性识别,右侧结构域定位E2酶以转移泛素分子。蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
蛋白质的泛素化修饰是一个可逆的过程,泛素化的逆向过程就是去泛素化过程。
(二)蛋白质降解
泛素-蛋白酶体途径是先发现的,也是较普遍的一种内源蛋白降解方式。需要降解的蛋白先被泛素化修饰,然后被蛋白酶体降解。
(三)蛋白质泛素化
蛋白质泛素化作用是后翻译修饰的一种常见形式,该过程能够调节不同细胞途径中各式各样的蛋白质底物。通过一个三酶级联(E1-E2-E3),蛋白质的泛素连接由E3泛素连接酶催化,这种酶是cullin-RING复合体超级家族的最佳代表。
在从酵母到人类的各级生物中都保守的DDB1-CUL4-ROC1复合体是最近确定出的cullin-RING泛素连接酶,这种酶调节DNA的修复、DNA复制和转录,它能被病毒所破坏。由于缺少一个规则的SKP1类cullin连接器和一种确定的底物召集结构域,人们还不清楚DDB1-CUL4-ROC1 E3复合体如何被装配起来以对各种蛋白质底物进行泛素化。
在这一项研究中,DDB1-CUL4A-ROC1复合体被病毒劫持的形式进行了晶体结构分析。分析结果表明DDB1利用一个β-propeller结构域作为cullin骨架结合物,利用一种多变的、附着的独立双β-propeller折叠来进行底物的呈递。通过对人类的DDB1和CUL4A复合体进行联系提纯,然后进行质谱分析,研究人员确定出了一种新颖的WD40-repeat蛋白家族,这类蛋白直接与DDB1的双propeller折叠结合并充当E3酶的底物募集模块。这些结构和蛋白质组学研究结果揭示出了cullin-RING E3复合体的一个新家族的装配和多功能型背后的结构机制和分子逻辑关系。
(四)泛素化类型
E1、E2、E3对底物的泛素化可形成几种不同的泛素化底物。有的底物蛋白只能被单泛素化,如H2B;有的底物蛋白有多个赖氨酸残基,在合适条件下会被多位点单泛素化;还有一些蛋白在单个赖氨酸位点会形成多聚泛素链,这种多聚泛素链可以根据连接泛素链的赖氨酸位点的不同可以分为单一、混合以及树枝状的结构。
(五)泛素化的作用、功能及其意义
泛素广泛存在于真核生物中,是由76个氨基酸组成的多肽,泛素的氨基酸序列高度保守,简单地说就是不容易发生突变,它在不同的物种中的序列是高度一致的,如果这些序列发生突变,功能就会受到影响,生命体就不能存活或者被会被自然选择淘汰掉,所以它在生物进化过程中很稳定。
1、泛素化修饰的作用
泛素化修饰是通过一系列的酶发挥作用,使得一个或者多个泛素分子和底物蛋白质的分子发生共价结合的一种蛋白翻译后修饰过程。泛素化修饰的主要作用为:
(1)泛素化修饰参与蛋白质的降解;
(2)泛素化修饰能够直接对蛋白质的活性和定位产生影响。
2、泛素化修饰的功能和意义
由于泛素化的多样性与多价性,泛素化广泛参与各种生理过程,包括细胞增殖、凋亡、自噬、内吞、DNA损伤修复以及免疫应答等。另外,泛素化失调在疾病中也发挥重要作用,如癌症、神经退行性病变、肌肉营养不良、免疫疾病以及代谢综合征。尤其对于肿瘤以及神经退行性病变,针对泛素化通路的调控已被认为是肿瘤及神经退行性病变的一种有前景的治疗策略。
为维持自身稳态,细胞必须能够及时回应内部及外部环境的各种变化,而针对特定蛋白质的翻译后修饰(PTM)正是一种极其敏感、迅速并且可逆的调节方式。小分子修饰如磷酸化、甲基化及乙酰化修饰的机制与功能在细胞生物学的各个方面都已得到广泛而深入的研究。与磷酸化、甲基化以及乙酰化修饰所添加的单一基团不同,泛素(Ub)是一种由76个氨基酸组成的小分子蛋白质,广泛存在于所有真核细胞中,且序列高度保守,从酵母到人仅相差3个氨基酸。泛素化作为一类作用方式更加复杂且作用结果更加多样的蛋白质修饰,在细胞生命周期的各个方面扮演着重要角色。通过对蛋白质稳定性、定位、活性以及相互作用的调控,泛素化广泛参与了诸如转录调节、DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、囊泡运输等生理过程。
泛素化过程通常需要3种泛素化酶的协同作用:E1泛素激活酶、E2泛素偶联酶和E3泛素连接酶。首先,E1利用ATP提供的能量在泛素C端赖氨酸(Lys)残基上的羧基基团与自身的半胱氨酸(Cys)残基上的巯基基团间形成高能硫酯键,从而活化泛素分子。然后,激活的泛素通过硫酯键再被接合到E2的Cys残基上。最终,激活的泛素或者通过E2直接连到蛋白底物上,或是在E3作用下通过泛素的羧基末端与靶蛋白Lys残基的ε-氨基之间形成氨基异肽键而将泛素转移到靶蛋白上。如果靶蛋白结合单个泛素分子,则称为单泛素化;如果靶蛋白的多个Lys残基同时被单个泛素分子标记,则称为多泛素化;而靶蛋白的单个Lys残基被多个泛素分子标记,则称为多聚泛素化。在这一系列酶促级联反应当中,E3在靶蛋白的特异性识别以及泛素化系统活性的调控中起着最重要的作用。
泛素分子全长包含7个赖氨酸位点(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)和1个位于C端的甘氨酸(Gly)位点以及位于N端的甲硫氨酸(Met1)位点。根据现有研究,无论在细胞内环境还是胞外反应体系,泛素自身的每个赖氨酸位点以及N端的甲硫氨酸(Met1)位点都可以发生泛素化从而延伸泛素链。其中对K48和K63位多聚泛素化的研究最广泛,而其他类型的泛素化链研究较少且被认为是非典型泛素化。但是随着对泛素化链的装配、识别以及水解的深入研究,非典型泛素化的功能与意义也逐渐得到了重视。
由于泛素化修饰对底物的巨大影响,因此与其他PTM如磷酸化、乙酰化相似,泛素化也是一个被严格调控的可逆过程,尤其是去泛素化酶使泛素化修饰具有良好的平衡性。研究表明,细胞内广泛存在许多去泛素化酶(DUBs),主要分为以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特异性加工酶家族为主的5种类型。去泛素化酶对泛素化过程不仅起着抑制作用,而且可以通过分解泛素化抑制因子、再循环泛素分子、校对泛素化进程等方式促进泛素化过程,从而与泛素化系统共同组成一个覆盖几乎所有细胞功能的复杂网络。
尽管许多泛素化修饰的机理得到了阐明,但泛素化修饰的生化机制与生理功能远未得到充分理解,例如,泛素化本身如何被调控以及泛素化与其他PTM如磷酸化、乙酰化之间的相互关系等。与此同时,对于泛素化修饰的进一步理解也必将推动一系列相关疾病的研究与治疗。关于线性泛素化通路与炎症、肿瘤、自身免疫性疾病相互关系的研究取得了巨大突破,并有望为上述疾病的治疗提供新思路。因此,随着对泛素化修饰的深入研究与治疗技术的不断发展,对泛素化通路进行操作将成为一种富有前景的高度特异性的治疗方法。
(六)去泛素化的作用
泛素化有一个重要的对立机制就是去泛素化,这一机制的存在,使得调控可以向两个方向进行,提高了细胞内信号通路的多样性。去泛素化功能的主要行使者是去泛素化酶,该酶与蛋白酶体存在着一定意义上的竞争关系。
泛素蛋白酶体途径(UPP)将不需要的蛋白质降解,被降解的蛋白质大多都是调节蛋白质,比如转录因子、发生折叠错误的蛋白质等,以保证细胞周期的正常进行,它通过调控蛋白质水平来参与机休多数生命过程。该途径最主要的是调控蛋白质降解,但是并非所有泛素化修饰都会使蛋白质降解,有些泛素化会导致蛋白质活性和结构的改变,产生一系列生物效应,如介导膜蛋白内吞作用、DNA损伤修复、机体免疫应答等。蛋白质翻译后修饰较为常见的有磷酸化、甲基化、乙酰化、谷氨酸化等小分子修饰,而泛素化是蛋白质更为有序、多样的修饰方式,其在细胞许多生命活动中发挥着重要作用,包括机体生长、发育、基因转录、细胞分化、凋亡等活动。
UPP属于非溶酶体途径降解蛋白的系统,相关研究证实UPP是稳定细胞内环境的重要因子,可使细胞内环境保持一种稳定状态,如果该稳态被打破,细胞就可能受到损伤。在细胞生理功能中,UPP参与多类蛋白质的后加工,如果在机体内累积大量的异常蛋白质,就会引发疾病,包含癌症、帕金森病、亭廷顿病等。
去泛素化酶的存在,使泛素化修饰成为一个被严格调控的可逆过程。去泛素化酶可通过切割多聚泛素链或者从修饰的底物蛋白中去除泛素,逆转泛素化过程,起到去泛素化的作用,逆向调节了蛋白质降解途径,从而影响了细胞内蛋白质的过能。去泛素化酶可以影响或调节众多细胞生物学过程,如细胞的基因表达、生长发育、细胞周期、信号转导、神经病变或肿瘤的发生等。对去泛素化酶进行深入研究,以期为探索疾病治疗药物新靶点提供科学依据。
三、去泛素化酶
除了泛素化酶外,细胞中还存在非常重要的去泛素化酶(DUB),其作用为去除蛋白质上的泛素链,从而调控蛋白的稳定性和功能。
(一)去泛素化酶的分类
去泛素化酶是一类数量众多的蛋白酶家族,根据其催化结构域的不同,主要分为以泛素特异性加工酶家族和泛素羧基末端水解酶家族为主的6个亚家族,包括泛素-特异性蛋白酶家族(USPs)、泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)、卵巢肿瘤蛋白酶家族(OTUs)、MJD结构域蛋白酶家族(MJDs)、MINDY蛋白酶家族(和JAMM蛋白酶家族,其中,除JAMM是锌金属肽酶外,其余5个去泛素化酶家族均为半胱氨酸肽酶。
(二)去泛素化酶的作用机制
去泛素化酶通过修剪泛素链或从修饰底物中特异性去除泛素来调节泛素信号,其主要作用于泛素-蛋白酶体系统中泛素化修饰后的蛋白底物,通过识别泛素分子、蛋白底物或者蛋白酶体的特异性序列,水解聚泛素链,将泛素蛋白从靶蛋白上解离出来,重新进入细胞内蛋白调节的循环中。DUB除了能特异性识别泛素分子的羧基未端,还可与泛素疏水区周围的大片区域相互作用,从而将底物上的泛素分子释放出来。它还可抑制E3连接酶的连接功能,主要是通过切割靶蛋白上的赖氨酸残基与泛素的C末端之间的肽键连接来实现的,影响了底物与泛素链的连接,以达到去泛素化的目的,从而增强了蛋白底物的稳定。此外,与一些特异性蛋白的结合可以使去泛素化酶间接激活,而这些特异性蛋白可引导去泛素化酶进入特别的途径或者帮助它们定位于特异性位点,从而达到逆转蛋白质降解的目的。由于去泛素化酶家族种类及其功能的复杂性,其具体的作用机制尚末十分明确,仍需我们不断的研究。
(三)去泛素化酶相关信号通路及疾病
1、Wnt/β-catenin信号通路
Wnt信号通路作为一条高度保守的信号转导通路途径,参与了动物个体发育各阶段及发育成熟器官的病理生理过程的调节,其中包括了胚胎的生长发育、组织结构的稳定、能量代谢的平衡以及干细胞的维持等过程。Wnt信号通路的异常激活与人类多种重大疾病有着密不可分的联系。
β-catenin作为经典Wnt信号通路的关键因子,其在胞质内富集并向细胞核内转移是Wnt信号通路活化的标志。正常情况下,体内β-catenin含量的稳定可通过泛素-蛋白酶体途径来维持。当去泛素化酶表达增加时,就会导致β-catenin含量增加,从而导致相关疾病的发生。例如,转录因子Tef/lef家族介导Wnt/β-catenin通路,参与脊椎动物胚胎发生和翻译后修饰等生物学过程。泛素羧基末端水解酶家族中的UCH37与转录因子7特异性结合,并使其去泛素化,激活Wnt/β-catenin信号传导途径,从而使β-catenin含量增加,进而导致细胞增殖异常及肿瘤的发生;USP7也可以通过对β-catenin去泛素化,在Wnt信号传导中起积极作用,促进结直肠肿瘤的生长,而其特异性抑制剂P5091可通过增强β-catenin的泛素化和亚序列降解而减弱Wnt信号途径转导的能力,抑制了结直肠癌细胞的增殖并诱导凋亡。另有研究表明,高氧暴露早期大鼠肺组织中泛素蛋白酶途径被激活,并参与了肺损伤过程。而以β-catenin为中心的Wnt/β-catenin信号途径也被证实了参与支气管肺发育不良(BPD)的发生。
2、TGF-β信号通路
转化生长因子β(TGF-β)是一类具有多种生物学活性的细胞因子,TGF-β信号通路在调节胚胎发育、细胞增殖和凋亡、免疫应答、伤口修复等过程中均起着关键性作用。通常情况下,TGF-β在肿瘤组织中的表达量较正常组织高。TGF-β信号通路与去泛素化酶密切相关,绝大多数的DUB可以通过减少相关分子的降解,使得TGF-β的浓度维持在一个高水平,从而导致了肿瘤的发生和转移。如,USP15是TGF-β受(TβR)的去泛素化酶,是TGF-β信号通路的关键组成部分。USP15的高表达与TGF-β高活化相关,在胶质母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌中均发现了USP15基因过度表达。在患有胶质母拥胞瘤的个体中,USP15过度表达提示了预后不良的可能。胶质母细胞瘤患者源性原位小鼠模型中,下调或抑制USP15可降低TGF-β的活性。此外,由于TGF-β信号的抑制,USP15的消耗降低了源自患者的神经胶质瘤引发细胞的致癌能力。结果表明,USP15调节TCF-β通路,是胶质母细胞瘤发病机制的一个关键因素。另有研究表明,Smad特异性E3泛素蛋白连接酶2(SMURF2)是USP15在TCF-β通路中的关键靶点。USPI5不仅可以直接靶向作用于TβR,还能使SMURF2去泛素化后在接触反应中失活,TβR的稳定性得以提高,两者共同作用提高了TGF-β受体含量,与肿瘤的形成有密不可分的关系。但并非所有的去泛素化酶都会对肿瘤的发生起促进作用,其中一小部分可抑制肿瘤的发生。肿瘤抑制因子(CYLD)就是其中之一,它作为Wnt/β-catenin和NF-κB信号传导途径的负调节因子,对多发性骨髓瘤(MM)细胞的增殖和存活有抑制作用,为治疗MM提供了一个靶点。此外,CYLD还是Smad的一种去泛素化酶,而Smad7又作为TGF-β通路的负性调控因子,因此CYLD水平的改变对癌症的发生发展存在一定的意义。TGF-β通路的异常活化,还可导致纤维性病变的发生。有研究发现:去泛素化酶家族中的UCH-L5能使Smad2、Smad3蛋白去泛素化,增强TGFβ-1信号通路转导,促进了肺纤维化;而UCH-L5抑制剂b-AP15则能够减弱TCFβ-1信号转导,从而减轻博来霉素诱发的肺纤维化小鼠肺纤维化程度。因此推测UCH-L5可能是治疗特发性肺纤维化新的治疗靶点。
3、在Aκt信号通路
蛋白激酶B(Aκt)是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,是胰岛素等生长因子的重要细胞内信号转导体,在葡萄糖代谢、细胞的增殖、代谢、转录、迁移和凋亡、血管生成、肿瘤侵袭等多种过程发挥重要作用。UCH-L1可以提高细胞的生存、迁移和增殖能力,除了在神经元中高表达外,还在人类多种瘤细胞中都存在高表达现象。研究表明,UCH-L1通过提高Aκt信号通路的表达来促进癌细胞的生长。
4、NF-κBb信号通路
核因子κB(NF-κB)是转录因子蛋白家族中的一员,普遍存在于多种组织细胞中,是重要的诱导性转录因子。除了参与机体正常的免疫反应、炎症级联反应、氧化应激、细胞生长、增殖和凋亡等生理过程外,NF-κB还与哮喘、(类)风湿性关节炎、心血管疾病、神经退行性疾病及癌症等疾病有着密切联系。锌指蛋白A20是炎性反应的内源性调控蛋白和组织细胞保护性蛋白,其抑制NF-κB信号通路的作用主要是通过阻止NF-κB信号通路上游因子的泛素化过程来实现的。研究表明,若A20基因表达受抑制,则可致肺泡巨噬细胞NF-κB活性升高,从而使TNF-α、IL-1β表达及分泌增加;反之,当A20基因过表达时,肺泡巨噬细胞NF-κB活性则被抑制,TNF-α、IL-1β表达和分泌减少;A20蛋白可以通过抑制肺泡巨噬细胞炎症反应活性,进而减轻了肺损伤。OTUs中的OTUD7B能通过对肿瘤坏死因子受体相关因子3去泛素化作用,从而阻止异常的非经典NF-κB途径激活。当OTUD7B被沉默后,肿瘤坏死因子受体相关因子6活动增强,NF-κB信号通路活化从而促使炎性基因表达。因此,抑制TRAF6泛素化的分子机制是减少缺氧组织炎症的潜在治疗靶点。
四、去泛素化酶研究新进展
(一)去泛素化酶的重要新作用
UAP14是与蛋白酶体结合的主要去泛素化酶之一,目前认为其主要功能是防止体内蛋白质被错误泛素化,从而参与调控蛋白降解过程,多项研究证明其在神经系统功能调控及肿瘤发生发展中具有重要作用,而且已有多个针对此靶点的小分子抑制剂用于抗肿瘤药物研发。
在一项最新研究中,来自湖北理工学院、中科院上海药物研究所和复旦大学中山医院的研究人员发表了题为"Proteome-wide analysis of USP14 substrates
revealed its role in hepatosteatosis via stabilization of FASN”的文章,通过多种蛋白质组学手段,系统性挖掘了USP14的底物靶蛋白,阐明了USP14在非酒精性脂肪肝(NAFLD)中的作用机制。
当前人类基因组中据推测大约编码了98种去泛素化酶,其中去泛素化酶USP14通过与蛋白酶体19s调节颗粒中的Rpn1可逆的结合,极大地增强了其去泛素化作用。近年来的研究表明,去泛素化酶USP14在信号通路转导、神经系统功能以及肿瘤发生发展等中具有重要作用,而且已经有很多针对该靶点的抗肿瘤药物研究并取得了一定的成果。然而,USP14是否还参与其它的生理病理过程还不清楚。
在这篇文章中,研究人员合作发现肥胖小鼠的USP14蛋白表达显著增加。他们利用稳定表达和敲除USP14的细胞系,通过大规模蛋白质-蛋白质相互作用组学、定量蛋白质组学以及泛素化组学的联合运用,以及生物信息学的综合分析发现,甘油三酯合成关键酶一一脂肪酸合成酶(FASN)是USP14的靶分子之一。
之后,研究团队进一步研究发现UPS14基因敲除小鼠的FASN表达水平降低,但通过静脉注射使USP14过表达之后,可以增加小鼠FASN蛋白水平,还可以使肝脏和血浆中甘油三酯水平升高,增加肝脏脂质沉积。同时,USP14沉默可以改善脂肪肝与胰岛素敏感性。综合而言,肥胖小鼠USP14表达增高,可以使FASN泛素化水平降低,使FASN蛋白稳定性增高,使甘油三酯合成增加,最终造成NAFLD水平增高。
这项研究工作揭示了泛素化酶USP14在脂肪肝发生发展中的重要新机制,并提示其作为治疗脂肪肝和相关代谢性疾病的潜在药物靶标。
(二)发现去泛素化酶OTUD3的新功能
近期的研究发现OTUD3能够直接与PTEN蛋白相互作用并稳定PTEN,从而拮抗PI3K/AKT信号通路,抑制乳腺癌的发生发展。在本次研究中,构建OTUD3因敲除小鼠,并与自发性乳腺癌小鼠和诱导性非小细胞肺癌(NSCLC)杂交,发现OTUD3缺失导致乳腺癌易感性增加,而NSCLC降低。通过对组织进行IHC免疫检测,发现在人乳腺癌、肝细胞癌、结肠癌和宫颈癌中,OTUD3的表达水平降低,同时PTEN降低,同样抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用。但是在人肺癌中却是出现了令人意外的结果,OTUD3的表达升高,促进了肺癌的发生发展。
为了解释OUTD3促进肺癌的分子机制,研究人员对OTUD3相互作用的伴侣蛋白进行了研究,发现GRP78与OTUD3之间有直接的相互作用。GRP78是HSP70家族的重要成员之一,调控内质网的稳态,发挥折叠和运输蛋白的作用,并促进肿瘤的增殖、转移及抑制凋亡,与肿瘤的耐药性密切相关。
在OTUD3过表达的细胞中去除内源性GRP78,可以抑制OTUD3诱导的细胞生长和迁移,在异种移植实验中GRP78缺失能够抑制肿瘤的发展,结果表明OTUD3通过调节GRP78促进了肿瘤的生长和转移。该研究首次鉴定出OTUD3是GRP78的去泛素化酶,在体内外导致肺癌细胞生长和肿瘤发生。
总之,该研究通过系统深入的研究,利用OTUD3基因敲除小鼠揭示不同肿瘤中的生物学功能。通过对不同癌症组织的免疫检测,确定OTUD3在肺癌中非但不能抑制肿瘤,反而发挥促癌功能,与其他癌症存在差异。
(三)揭示去泛素化酶调控DNA损伤修复新机制
2019年12月24日,Cancer Research在线发表了北京大学生命科学学院郑晓略教授课题组题为"The Deubiqui tinase USP38 Promotes NHEJ Repairthrough of HDAC1 Activity and RegulatesCancer Cell Response Genotoxie Insults"的研究文章。该研究鉴定了一个在DNA损伤应答中发挥作用的新的去泛素化酶USP38。他们发现,USP38通过去除去乙酰化酶HDAC1的泛素化修饰来抑制HDAC1的去乙酰化酶活性,进而调控DNA双链断裂主要修复途径之一的非同源未端连接修复(NHEJ)的修复效率,在细胞基因组稳定性维持中发挥重要作用。这项研究揭示了去泛素化酶参与调控DNA损伤调控的新机制。
DNA损伤修复通路(DDR)在维持细胞基因组稳定性中发挥着重要作用。DNA损伤修复受到泛素化等蛋白质翻译后修饰的严格而精细的调控,其中,去泛素化酶通过两种主要方式参与到DNA损伤修复过程:直接作用到损伤位点或者调控DNA损伤应答关键的因子。鉴于DNA损伤应答调控的复杂性,鉴定新的参与到DA损伤修复中的去泛素化酶,阐明其发挥作用的机制,有助于我们深入了解DDR修复的分子机制。
该研究通过激光微辐射和中彗星实验发现,去泛素化酶USP38能够被募集到DNA损伤位点,在细胞基因组稳定性的调控中至关重要。课题组进一步研究发现,USP38可以去除去乙酰化酶HDAC1的K63位连接的多聚泛素化修饰,进而上调HDAC1的去乙酰化酶活性,去除H3K56的乙酰化修饰,提高NHEJ的修复效率。
生物信息分析和免疫组化的研究结果表明,USP38在大多数种类肿瘤中具有低表达的现象。在肾癌细胞系和小鼠中,USP38的缺失都会导致基因组的不稳定性,并且导致细胞和小鼠对于DNA损伤刺激更为敏感。与野生型小鼠的高存活相反,USP38-/-小鼠在IR照射后20天内全部死,进一步证明USP38对于维持细胞的损伤修复效率和基因组稳定性是至关重要的。
(四)发现去泛素化酶复合体的作用新机制
病毒在与宿主共进化过程中形成了对机体抗病毒免疫反应的精巧调节,从而逃避免疫系统攻击。因此,揭示病毒与宿主间的相互作用、阐明机体抗病毒免疫反应的调控机制,对于预防和控制病毒性疾病具有重要的理论和现实意义。
山东大学基础医学研究院研究人员发现,USP1-UAF1去泛素化酶复合体能通过稳定TBK1表达而促进抗病毒反应,这一研究发现了病毒、宿主相互作用的关键节点分子,可为抗病毒药物研制提供更为理想的靶点。
研究人员发现可通过诱导去泛素化酶复合体USP1-UAF1的表达,进而促进RNA病毒和DNA病毒感染诱导的I型干扰素表达,最终抑制病毒复制。从机制上,研究人员发现USP1-UAF1通过特异性结合抗病毒天然免疫信号通路中的关键激酶TBK1,抑制TBK1发生泛素蛋白酶体途径的降解而发挥促进抗病毒信号通路活化的作用。该研究首次揭示了病毒感染过程中,机体如何通过稳定TBK1表达、促进抗病毒反应,迅速有效地清除入侵病毒,并进一步揭示了抗病毒天然免疫信号网络。相关研究成果发表在《实验医学杂志》。
(五)去泛素化酶与肿瘤
泛素化调节是一个可逆过程,可被泛素连接酶(E3)和去泛素化酶(DUB)拮抗调控。去泛素化酶可介导底物蛋白质去泛素化,调节蛋白质功能,参与细胞各项生命活动。去泛素化酶的蛋白质丰度、定位和催化活性等受到严格调控。在肿瘤的发生发展过程中,有许多与肿瘤相关的重要抑癌或者促癌蛋白质被去泛素化酶调控,而且去泛素化酶的表达异常、突变等都会影响细胞DNA损伤修复、凋亡、自噬、分子信号通路和染色质重塑等,从而调控肿瘤细胞的生长侵袭和转移等过程。
泛素化和去泛素化是机体中调控蛋白质降解的重要分子机制。去泛素化酶通过多种分子通路参与调控肿瘤细胞的存活、增殖和侵袭等过程,在多种细胞生命活动中均扮演着重要角色。目前研究表明,尽管少数去泛素化酶具有一定的抑癌作用,但绝大多数去泛素化酶发挥着显著的促肿瘤作用,去泛素化酶系统是参与肿瘤调控的重要蛋白质,也是肿瘤的重要药物靶标,因此被认为是前景良好的抗肿瘤靶点。
泛素化调节系统比较复杂,一个去泛素化酶参与到多个底物的调控,一个底物也可以被多种去泛素化酶调节,以及泛素连接酶和去泛素化酶间的动态变化。所以,在不同组织的肿瘤中,或者不同类型的肿瘤中,去泛素化酶表现出促癌和抑癌的功能双重性,为去泛素化酶的临床转化研究带来困难。因此,鉴定目的蛋白质的特异性去泛素化酶或者某一去泛素化酶调节的主要靶蛋白质尤为重要。尽管已经确定了一些去泛素化酶的底物,但是大多数去泛素化酶的底物和功能都有待深人研究。通过高通量多组学的方法系统性筛选某一特定组织类型或功能中起主导作用的去泛素化酶和底物蛋白质,是目前该领域的研究趋势。例如,CRISPR筛选鉴定调节性T细胞(Treg)Foxp3的调节因子,发现USP22是稳定Foxp3表达的主要调节蛋白质。目前,去泛素化酶系统有6个家族分类。根据结构和酶学特征,鉴定新的去泛素化酶成员也是该领域研究的一个方向。
去泛素化酶在肿瘤和其他疾病中具有重要的调控作用,也是药物设计和治疗的靶点。研究已经发现一些针对去泛素化酶的抑制剂,通过调节DNA损伤修复与细胞周期、细胞生长和凋亡等过程,在肿瘤的治疗和预后判断中发挥作用。由于去泛素化酶家族催化结构的保守性,所以一些抑制剂通常靶向多个去泛素化酶,而一个去泛素化酶又靶向多个底物蛋白,这些都为抑制剂药物带来不良作用。因此,根据去泛素化酶与泛素连接酶或者底物蛋白质的相互作用,以及其催化位点的相互作用,设计特异性高的去泛素化酶和泛素连接酶的激动剂或者抑制剂是该领域的重要工作内容。同时,系统性高通量筛选抑制剂分子库,鉴定去泛素化酶特异性高的抑制剂也非常重要。鉴于去泛素化酶在机体各项生命活动中的功能多样性,去泛素化修饰领域仍需深人探究。
五、去泛素化酶抑制剂
泛素修饰系统一个很重要的特点就是去泛素化酶的存在导致修饰反应的可逆性。这种可逆性能够维持细胞内单泛素化的稳态。去泛素化酶负责切割靶蛋白的泛素标签,因此去泛素化酶抑制能够引起大量泛素化蛋白的聚集。与蛋白酶体抑制剂引起泛素蛋白聚集不同的是,大部分去泛素化酶抑制剂只针对特异的一种或几种去泛素化酶,从而选择性地调控相关蛋白的变化,比蛋白酶体抑制剂更具有特异性和选择性。因此,寻找去泛素化酶抑制剂对于肿瘤及其他疾病的治疗具有重要的应用价值,成为药物研发的一个热点。
目前,去泛素化酶抑制剂主要以小分子为主,大多处于临床前或临床研究阶段,尚无获批上市的药物。
根据去泛素化酶不同的活性位点,去泛素化酶抑制剂研究的主要靶点主要是半胱氨酸依赖的蛋白酶和锌离子依赖的金属酶。半胱氨酸依赖的蛋白酶主要有:泛素特异性蛋白酶(USPs)、泛素羧基端水解酶(UCHs)、卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)、马查多-约瑟夫病蛋白质结构域蛋白酶(MJDs)、MINDY蛋白酶家族等。锌离子依赖的金属酶主要有JAMM/MPN去域相关金属肽酶等。其中,USPs家族是去泛素化酶中数量最多的家族,人类基因编码的有约50余种,目前对该家族的研究最多,靶向该家族的抑制剂研究也最多。
自噬是进化上高度保守并受到多途径严密调控的细胞生物学过程,其向溶酶体递送多种细胞质组分以进行细胞内物质的降解以及再循环。这一过程涉及到细胞器的更新、错误折叠蛋白质和蛋白质聚集体以及细胞内病原体的清除。因此,自噬对于细胞稳态的维持至关重要,与许多人类疾病的发生发展密切相关。随着细胞自噬调节机制研究的不断深入,越来越多的去泛素化酶被证明在自噬相关的泛素信号调控系统中发挥了重要的作用。这些去泛素化酶作用于细胞自噬的不同阶段,靶向调节不同的泛素化自噬功能元件或自噬底物。去泛素化酶作为包括神经退行性疾病以及肿瘤在内的细胞自噬的治疗靶点受到了广泛关注,其中各类小分子抑制剂的发现为进一步研究去泛素化酶的自噬调节活性及相关疾病的治疗提供了可能。
尽管已经开展了大量的相关研究工作,但对于去泛素化酶功能的认识仍然非常有限,主要有以下几个方面的原因:一是去泛素化酶种类和数量多样化,并且自身可能受到多种形式的复杂调控;二是一些去泛素化酶可能作用于平行的通路互为补偿;三是一个去泛素化酶可以通过多个不同的底物调节多条信号通路。一个解决问题的有效途径是利用各类不同的体内外模型,借助它们各自的方法学优势来做分析;另一个重要的途径就是寻找特异性的抑制剂,并对其有效性、选择性和脱靶效应进行准确的评估。
由于去泛素化的过程发生在细胞内,所以小分子化合物仍然是目前去泛素化酶抑制剂的首要研发方向。因为许多去泛素化酶拥有相似的序列和结构,并且它们大多存在变构效应,在活性状态和非活性状态间转换,而且常常是作为蛋白质复合物或者是庞大的分子机器中的其中一个组成部分来发挥功能,这些都为寻找特异性去泛素化酶的小分子抑制剂带来了困难。但随着去泛素化酶生化分析和筛选技术的重大改进,不断有小分子去泛素化酶抑制剂被发现,并被运用于药物的临床前研究。这类抑制剂及其衍生物不仅为发现具有临床价值的药物分子提供了基础,在新药研发中发挥了先导化合物的作用,也作为一种有力的工具用以研究去泛素化酶的细胞生物学特性和调控机制,或是在各类疾病模型中验证治疗假设,为包括神经退行性疾病和癌症在内的相关疾病的靶向治疗提供思路和指导。
六、展望
蛋白质去泛素化与泛素化的动态平衡与稳定,在机体众多生命活动的过程中扮演了一个相当重要的角色。近年来研究相关疾病与去泛素化酶之间的关系已成为热点。去泛素化酶在蛋白质转换、定位和细胞内稳态等多种细胞过程中具有重要的作用,是一种很有前途的治疗靶点。但其致病机理及其疾病的发展中的具体机制尚未十分明确,仍需要我们进一步深人研究。因此,研究去泛素化酶及其相关通路与疾病的关系,有望研究出一些有效的治疗靶点和药物,可能为疾病的治疗和预防提供新的线索和方法。
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