三磷酸腺苷（ATP）是一种辅酶，有改善机体代谢的作用，参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸以及核苷酸的代谢。同时又是体内能量的主要来源，当体内吸收、分泌、肌肉收缩及进行生化合成反应等需要能量时，三磷腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基，同时释放出能量。

裂解酶是催化多聚链从内部或端部裂解的酶类。三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶（ACLY）是脂肪酸生物合成中催化重要步骤的一个酶，是糖代谢（产能）与产生脂肪酸之间的桥梁。

ACLY是一种ATP依赖性的中心代谢酶，是一种胞质同源四聚体酶，在ATP的作用下，ACLY可以催化柠檬酸和辅酶A转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸酯。由于ACLY是产生胞浆乙酰辅酶A的主要酶，而乙酰辅酶A对脂肪酸代谢、胆固醇的生物合成、蛋白质乙酰化和异戊烯化等生化过程致关重要，是胆固醇和脂肪酸从头合成所需的前体，因此抑制ACLY有可能达到减少乙酰辅酶A的生成从而降低胆固醇和甘油三酯水平的目的。由于许多癌细胞的增殖取决于ACLY的活性，因此ACLY是抗癌药物作用的重要靶点。此外，ACLY还是抗血脂障碍和肝细胞脂肪变性的靶标。到目前为止，已经发现了许多ACLY抑制剂，但大部分活性较弱。因此，深入研究ACLY的结构及ACLY与高脂血症、肿瘤、肝细胞脂肪性病变等疾病的关系，对于疾病防控和治疗药物研发具有重要意义。

一、三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶

ACLY是许多组织中合成胞内乙酰辅酶A的主要酶。它是一种胞浆酶，能够催化依赖ATP和依赖辅酶A（CoA）的柠檬酸（Krebs循环的代谢产物）转化为草酸乙酸酯和高能生物合成前体乙酰辅酶A，ATP也在此过程中水解成ADP和无机磷酸盐。乙酰辅酶A是胆固醇的二碳单位供体，它可为关键的生化反应提供燃料，如合成脂肪酸、胆固醇和乙酰胆碱，也支持组蛋白和与代谢相关的酶的乙酰化。在自养原核生物中，ACLY是反向Krebs循环（也称还原性三羧酸循环）的标志性酶，该循环将两个二氧化碳分子固定在乙酰辅酶A上。在人类中，ACLY在肝脏和脂肪组织以及胆碱能神经元中强烈表达，它成为碳水化合物和脂质代谢联系的桥梁。

（一）三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶结构

ACLY属于酰基辅酶A合成酶（核苷二磷酸形成）超家族，ACLY蛋白是由4个相同亚基组成的同源四聚体，可分为6个结构域，每个多肽链包含1101个氨基酸残基。它的每个亚基是由N端的柠檬基-CoA合成酶（CCS）模块和C端的柠檬基-CoA裂解酶（CCL）结构域组成的，其中CCS模块部分又包含CCSα和CCSβ两个区域。靠近N端处为由结构域3、4、5组成的CCSβ亚基，结构域3和4上采用了ATP-grasp折叠的方式，能够结合ATP，结构域5也包含柠檬酸的结合位点；与CCSβ亚基相连的是CCSα亚基，它由结构域1、2组成，结构域1上含有CoA结合位点，结构域2包含催化机制所需的磷酸化组氨酸残基（His760），可以调节酶的活性，His760是催化反应的关键位点；结构域5与2之间可相互作用，形成N端含有磷酸化组氨酸残基的两个“幂螺旋”之一；结构域5和1之间有一段残基可以在3个丝氨酸或苏氨酸残基上磷酸化；靠近C端的CCL模块包含4个类似柠檬酸合成酶（CS）的CoA结合域。

Sun等在研究人类的ACLY的晶体结构过程中，成功结晶了酶的一种截断形式，从这些研究中获得的X射线晶体学数据揭示了ACLY大约三分之二的结构。

他们确定了被定义为柠檬酸结合位点的一个环，这个环由残基Ser343-Thr348形成。柠檬酸含有3个羧基和1个羟基，因它含有1个前手性中心，可以区分两个末端羧基，分别为pro-R和pro-S。柠檬酸分子的pro-R和pro-S羧基在非酶促反应中无法区分，ACLY允许pro-S羧基具有反应性，但使pro-R羧基保持不活跃状态，这导致反应中间体柠檬基-磷酸和柠檬基-CoA具有S构型。当柠檬酸与ACLY结合时，Ser343-Thr348残基通过氢键与柠檬酸前手性中心的羟基和羧基相互作用，pro-R基与Arg379形成强烈的离子相互作用且两者之间存在盐桥。中心的-COOH基团与Thr348的侧链以及Asn346和Thr348的主链通过氢键，而羟基与Thr348的侧链与Gly309的主链相互作用。蛋白质与柠檬酸中心羧基和羟基的作用不能互换。这两个取代基在手性中心的取向迫使pro-R羧基指向Arg-379，柠檬酸的pro-S羧基暴露并自由地与磷酸组氨酸残基反应。一旦柠檬酸被磷酸化，CoA的游离硫醇就会与这个pro-S羧基反应生成柠檬基-CoA。

（二）三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶生化反应作用机制

ACLY催化的酶促反应主要是通过以下4个步骤：

1、ACLY在活性位点的组氨酸残基上与ATP发生磷酸化反应，形成了ACL-P，Mg-ATP与游离酶进行结合，引起Mg-ADP的释放，这个游离酶可以催化保守的组氨酸残基的磷酸化，初始磷酸化过程发生在His760上，His760是人类亚型中的磷酸盐受体；

2、磷酸基从His760转移到柠檬酸上，再由磷酸酶催化柠檬酸磷酸酯的形成；

3、在以上第2步形成的柠檬酸磷酸酯被CoA的硫醇基团攻击，CoA在攻击中可在柠檬酸根和CoA之间形成柠檬基-CoA硫酯键，并释放无机磷酸（Pi）；

4、酶结合的中间体柠檬酰基-CoA在逆向Claisen反应中被裂解，从酶活性位点释放乙酰辅酶A和草酰乙酸。

（三）三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶与脂质代谢

ACLY在脂质代谢中起着十分重要的作用。ACLY是一种胞浆酶，在肝脏和白色脂肪等组织中表达最高。ACLY是胞浆中乙酰辅酶A的主要贡献者。肝脏是脂蛋白合成的重要器官，ACLY作为蛋白合成的重要酶，它可为脂肪酸合成途径和甲羟戊酸途径提供胞内乙酰辅酶A。脂质的生物合成始于线粒体，但乙酰辅酶A无法穿过线粒体膜，所以它不能离开线粒体而产生乙酰基，而乙酰基正是启动脂质形成过程中所必需的。在柠檬酸合酶的帮助下，来自非脂质营养物质代谢的乙酰辅酶A与草酰乙酸脂（通过三羧酸循环）缩合形成柠檬酸，再由柠檬酸转运载体输出到细胞质中。随后，胞浆中的ACLY将柠檬酸裂解成乙酰辅酶A，为胆固醇和脂肪酸的合成提供原料。细胞内乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的作用下转化为丙二酰辅酶A后进入脂肪酸合成途径，或通过一系列缩合反应进入甲羟戊酸途径，再被HMG-CoA还原酶（HMGR）还原为甲羟戊酸，这两个步骤均为限速步骤。ACC是从头合成脂肪酸的限速酶，它可使乙酰辅酶A发生羧化反应生成丙二酰辅酶A，再通过从头合成脂肪酸的4个反应周期，合成棕榈酸，这种修饰会导致脂肪酸的产生。在甲羟戊酸途径中，ACLY提供的乙酰辅酶A主要用于胆固醇合成：乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A经HMG-CoA合成酶催化缩合形成HMG-CoA，再被3-羟基-3-甲基戊二酸-辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶）还原为甲羟戊酸；甲羟戊酸通过需要ATP的3个连续反应转化为3-异戊烯基焦磷酸酯；多个延伸步骤包括重复添加额外的5-碳模块生成角鲨烯，角鲨烯环化形成羊毛甾醇；羊毛甾醇脱去3个甲基加上1个双键的还原和另1个双键的迁移等一系列过程后，最终生成胆固醇。甲羟戊酸不仅是胆固醇生物合成途径中HMG-CoA还原酶的产物，也是合成几个重要的生物中间体和产物的基础，包括异戊二烯类化合物、辅酶Q10和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶。当养分供应超过生物合成和能量需求时，细胞利用这一途径将脂类酯转化成胆固醇酯和甘油三酯的形式来储存能量。

（四）三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶与糖代谢

ACLY不仅与脂代谢紧密相关，它还参与了葡萄糖的代谢。研究表明，肿瘤细胞中伴随着能量代谢的改变，代谢失调对肿瘤的发生发展也有着极大的影响。葡萄糖糖酵解和脂质的从头合成都是肿瘤细胞重要的特征。ACLY可通过靶向下游效应器来影响葡萄糖的代谢。葡萄糖的糖酵解过程可以提供生物所需的能量，特别是在癌细胞中，它十分依赖糖酵解过程来获取能量，表现为葡萄糖的摄取增加以及糖酵解活跃这称为“Warburgeffect”。葡萄糖的分解代谢升高会导致糖酵解最终产物丙酮酸的过量产生，丙酮酸有两个去向：一是被乳酸脱氢酶转化为乳酸，二是进入线粒体后引起线粒体中柠檬酸浓度的上升，柠檬酸被载体运输到细胞质中，被ACLY裂解生成乙酰辅酶A。ACLY是长链脂肪酸合成的上游酶，可为脂肪酸的合成提供所需的乙酰辅酶A。由此可见，ACLY将糖酵解的分解代谢途径和脂肪酸的生物合成两个过程很好地联系起来，中间产物柠檬酸既是糖酵解代谢产物的抑制剂，也是乙酰辅酶A从头合成脂肪酸的前提。因此，ACLY的活性会影响葡萄糖的酵解产生ATP和脂质合成两大过程。已有研究证明，ACLY在永生化细胞和各种肿瘤中的表达相对于正常细胞普遍上调，出现异常的高表达，包括在乳腺、结肠、肝脏、肺、胃和前列腺肿瘤以及胶质母细胞瘤中，且ACLY在上述类型的癌症中表现为负面的预后因子。在培养的癌细胞中，ACLY表达增加也会促进癌细胞的增殖以及延长存活时间。所以，ACLY也作为癌症治疗的一个有效靶点。

ACLY在糖酵解过程中作为级联反应的最终酶，在脂质合成过程中作为起点。ACLY是脂质合成的起点，可以通过靶向上游效应器来影响脂质的合成。考虑到ACLY在脂肪生成中的生理作用以及同时影响脂质和胆固醇的合成，该酶一直被认为是治疗肿瘤、高脂血症和高胆固醇血症的药物靶点。

二、三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶研究进展

（一）发现三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶乙酰化促进脂类生物合成及肿瘤生长机制

来自复旦大学、上海交通大学医学院的研究人员的研究证实，ACLY乙酰化促进了脂类生物合成及肿瘤生长机制，相关研究成果发表在《分子细胞》（Molecular Cell）杂志上。

代谢信号通路显著重编程是癌细胞最重要及常见的特征之一。由于癌细胞增殖速度快，对于能量和大分子的需求增高。为了满足这些增高的要求，癌细胞代谢信号会发生重要的改变。癌细胞最重要的代谢标志之一就是脂类从头合成。脂类合成信号涉及了脂肪酸合成信号和甲戊酸信号，后者导致了胆固醇和类异戊二烯合成。

各种肿瘤均显示内源性脂肪酸生物合成增高。而大多数的正常细胞，即使是有着相对较高的增殖速度也是优先利用饮食中和/或内源性的脂类来合成新的结构脂类。尽管一些正常组织，如脂肪细胞、肝细胞、激素敏感细胞和胎肺组织具有非常活跃的脂肪酸合成信号，但在大多数正常细胞中脂肪酸从头合成均受到抑制。在癌细胞中脂肪酸合成上调促进了膜生物合成，使得膜脂更为饱和，由此影响了信号传导、基因表达、纤毛发生和治疗反应的许多的基础细胞过程。在肿瘤细胞中脂肪酸合成上调受到大量参与脂肪酸合成信号通路的酶表达和活性显著升高的影响。

ACLY是一种可催化柠檬酸盐生成乙酰辅酶A（CoA）的胞质酶。乙酰辅酶A是内源性脂肪酸和胆固醇生物合成的重要基础材料，并参与了以类异戊二烯为基础的蛋白质修饰。乙酰辅酶A还是诸如组蛋白乙酰化等蛋白质修饰乙酰化反应的必要条件。在几种癌症中都有ACLY上调或激活，已知当ACLY受到抑制时会诱导体内外的癌细胞增殖阻滞。

研究人员证实，当在高糖下受到PCAF乙酰转移酶的刺激时，ACLY的赖氨酸残基540、546和554（3K）位点会发生乙酰化，其通过阻断ACLY泛素化和降解提高了其稳定性。与之相反，去乙酰化酶SIRT2则可使得ACLY脱乙酰化，从而导致其失去稳定。置换540、546和554（3k）位点可破坏ACLY的泛素化，促进脂类从头合成、细胞增殖及肿瘤生长。重要的是，研究人员在人类肺癌中证实ACLY 3K乙酰化水平增高。这些研究结果表明，ACLY乙酰化和泛素化之间存在相互串扰，它们通过竞争相同的赖氨酸残基调控了响应葡萄糖的脂肪酸合成和细胞生长。

（二）发现有效抑制三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶的变构机制

美国哥伦比亚大学的科研人员在Nature上发表了题为“An allosteric mechansm for potent inhibition of human ATP-citrate lyase”的文章，研究人员对ACLY的三维结构进行了解析，阐明了在抑制剂作用下的变构机制，为通过该分子靶标治疗肿瘤奠定了基础。

由于许多癌细胞的增殖取决于ACLY的活性，因此ACLY是抗癌药物作用的重要靶点。此外，ACLY也是抗血脂障碍和肝细胞脂肪变性的靶标。到目前为止，已经发现了许多ACLY抑制剂，但大部分活性较弱。研究人员对低抑制剂量的小分子抑制剂进行了研究，通过冷冻电镜确定了抑制剂NDI-091143与人全长ACLY同型四聚体相互作用时的结构特征，发现了全新的抑制机制。该化合物的结合位点主要位于柠檬酸结合位点旁的疏水性变构空腔中。NDI-091143与ACLY结合后，通过较大的构象变化，间接破坏酶与柠檬酸的结合，该结合作用模式解释了此类化合物结构与活性的关系。该变构位点的阐明极大地增强了ACLY的“可药性”，使ACLY成为更具吸引力的肿瘤治疗靶标，为开发新的ACLY抑制剂提供理论依据。

（三）揭示三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶全酶结构

三羧酸循环是三大营养（糖类、脂类、氨基酸）代谢的共同通路，也是糖类、脂类、氨基酸合成和转化的枢纽。ACLY是连接葡萄糖分解代谢和胆固醇、脂肪合成代谢过程中最重要的酶，在ATP和辅酶A（CoA）存在下能催化细胞质中的柠檬酸生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。乙酰辅酶A不仅是胆固醇和脂肪酸从头合成的重要原料，还是蛋白质乙酰化修饰反应的底物。

研究表明，ACLY在肝癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌等多种癌症中蛋白表达量增加，敲低或抑制ACLY的酶活可使癌细胞生长受阻。因此，乙酰辅酶A的代谢调控有望成为肿瘤治疗的一种新手段。阐明ACLY结构，成为相关药物设计的基础。

比利时大学生物化学与微生物系的Kenneth Verstrete团队分别在Nature上发表了题为“Structure of ATP citrate lyase and the origin of synthase in the Krebs cycle”研究文论文，报道了ACLY全酶聚体四聚体的三维结构，并揭示了还原型和氧化型三羧酸循环中柠檬酸合酶的演化。

通过结构可以看出ACLY四聚体是通过催化中心结构域CS（citryl-CoA转变成OAA和乙酰辅酶A）的α螺旋紧密结合形成了四个原聚体，蛋白N端位于外围；Citryl-CoA在一个原聚体N端柠檬酸和CoA结合结构域形成，然后转位到另一个原聚体CCLY活性位点完成催化反应，该结构也解释了ACLY只能在四聚体形式才能完成整个反应的原因。

三羧酸循环分为自养生物的还原型（三羧酸循环逆向进行，将二氧化碳中的碳原子还原为有机物）和异养生物的氧化型（将有机物碳原子氧化成为二氧化碳）。Kenneth Verstraete团队解析了自养生物如泥生绿菌（C.limicola，分布于无氧、含硫化氢的水体中呈杆状、卵状或弧状、不运动和不放氧光合的细菌）和嗜热栖热菌（H. thermophiles，能在45℃或45℃以上，pH在3.0以下的环境中生长，能氧化亚铁、元素硫、还原态无机硫化物和硫化矿物的耐热嗜酸细菌），古菌如产甲烷菌（M.concilif，能将无机物厌氧发酵转化成甲烷和二氧化碳的古细菌），异养生物如人类ACLY的晶体结构。

通过比较柠檬酸合酶（CS）和柠檬酰-CoA裂解酶（CCL）的DNA序列还不能完全阐明它们的演化关系，但是通过它们的晶型结构可以清晰地看到氧化型三羧酸循环的第一个酶（CS）是从还原型三羧酸循环的CCL演化而来。该研究应用传统的晶体学方法解析了ACLY的结构，并明确了CS与CCL的演化关系，为氧化型三磷酸循环的演化提供了新的见解。

三、三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶抑制剂

目前，ACLY抑制剂主要集中在高脂血症和肿瘤治疗领域。许多ACLY抑制剂被评估为在阻断或减少脂肪酸或胆固醇合成的治疗以及抗肿瘤治疗中有很好的潜在作用。已经有多个动物实验和人类临床试验证明，ACLY抑制剂可以显著改善血脂紊乱情况，也在抑制动脉粥样硬化病变有着良好的效果。这些抑制剂具有与他汀类药物相当的效果，并且比其他非他汀类降脂药物（尤其在降低LDLC方面）有一些潜在的优势。已有临床证据显示，在服用他汀药物最大的耐受剂量的治疗后仍达不到LDL-C目标时，bempedoi acid作为单一疗法或与ezetimibe或他汀类药物联用对降低LDL-C有着显著的效果，若对于他汀类药物不耐受或不能使用的患者联合其他降脂药物如ezetimib也具有良好作用。如今，bempedoic acid已获得美国FDA的批准，这也是近20年来美国首次批准的新型口服降脂药物，这说明ACLY抑制剂在降低血脂方面具有良好的发展前景。

以ACLY作为潜在靶点开发新的抑制剂，可以从多方面进行考虑。一方面可以从其结构出发，与其他通路上作用于血脂的靶点相结合，设计双靶标抑制剂以达到更好的多重抑制效果；另一方面可以通过分子对接等手段进行虚拟药物筛选，并基于已报道的能有效抑制ACLY的变构机制及位点，以期找到有效的小分子能作为ACLY的高亲和力抑制剂；对于一些已证明有抑制活性但是因细胞通透性或者细胞毒性的限制而无法使用的，可以考虑在结构上进行适当的改造。

ACLY在脂代谢中处于战略性地位，它很可能为血脂异常患者降低其血脂或抗肿瘤增殖提供一个独特有效的治疗效果。如今已有一些研究调查了ACLY的药理或遗传抑制是否可以在不增加不良作用的情况下降低血浆LDL-C的水平或抗肿瘤增殖的能力。未来的研究还需根据ACLY的作用机制，探讨ACLY在代谢途径调节中的作用及其治疗潜力，研究设计开发出更多安全高效的抑制剂，从而达到更好的降血脂或抗肿瘤效果。

 

文献资料

1、席勤妹等，ATP-柠檬酸裂解酶抑制剂bempedoic acid，中国新药与临床杂志，2018，37（12）：674～677

2、陈诗宇等，新靶点三磷酸腺苷柠檬酸裂解酶（ACLY）抑制剂用于降血脂的研究进展，药学学报，2021，56（1）：80～91

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