表观遗传学与疾病
发布时间:2021-11-19 08:35:00 | 来源:【药物研发团队 2021-11-19】
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化、基因组印记、母体效应、基因沉默、核仁显性、休眠转座子激活和RNA编辑等。
表观遗传学是与遗传学相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等;而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和染色质构象变化等;表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。表观遗传机制主要在基因转录层面调控基因表达。
表观遗传是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变,即基因型未发生变化而表型却发生改变,且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。表观遗传学调控真核基因表达,与人类重大疾病,如肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫性疾病等密切相关,一直以来都是生命科学研究领域的一个热点。
一、表观遗传学定义
在生物学中,表观遗传学指的是基因表达中的多种变化。这种变化在细胞分裂的过程中,有时甚至是在隔代遗传中保持稳定,但是不涉及到基本DNA的改变。意味着即使环境因素会导致生物的基因表达出不同,但是基因本身不会发生改变。表观遗传学在真核生物中的变化主要被举例为细胞分化过程中干细胞分化成与胚胎有关的多种细胞这一过程。这个过程通过一些可能包含某些基因的沉默,移除某些基因上沉默的标志并且永久的失活于其他基因的机制变得稳定。
一直以来人们都认为基因组DNA决定着生物体的全部表型,但逐渐发现有些现象无法用经典遗传学理论解释,比如基因完全相同的同卵双生双胞胎在同样的环境中长大后,他们在性格、健康等方面会有较大的差异。这说明在DNA序列没有发生变化的情况下,生物体的一些表型却发生了改变。因此,科学家们又提出表观遗传学的概念,它是在研究与经典遗传学不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的一门前沿学科,它是与经典遗传学相对应的概念。现在人们认为,基因组含有两类遗传信息,一类是传统意义上的遗传信息,即基因组DNA序列所提供的遗传信息,另一类则是表观遗传学信息,即基因组DNA的修饰,它提供了何时、何地、以何种方式去应用DNA遗传信息的指令。
二、表观遗传学特点
表观遗传学主要有以下特点:
1、可遗传,即这类改变通过有丝分裂或减数分裂,能在细胞或个体世代间遗传。
2、可逆性的基因表达。
3、没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。
三、表观遗传学调控机制
表观遗传调控是指通过表观遗传修饰方式(如甲基化、乙酰化、磷酸化等)对细胞内核酸或蛋白质的含量与功能进行调节的过程。
表观遗传学主要有以下调控机制:
1、DNA修饰
DNA修饰是指DNA共价结合一个修饰基团,使具有相同序列的等位基因处于不同修饰状态。DNA甲基化是目前研究最充分的表观遗传修饰形式。正常的甲基化对于维持细胞的生长及代谢等是必需的,而异常的DNA甲基化则会引发疾病(如肿瘤),因为异常的甲基化一方面可能使抑癌基因无法转录,另一方面也会导致基因组不稳定。因此,研究DNA甲基化对于了解生物生长发育及疾病治疗是非常有帮助的。
2、组蛋白修饰
真核生物DNA被组蛋白组成的核小体紧密包绕,组蛋白上的许多位点都可以被修饰,尤其是赖氨酸。组蛋白修饰可影响组蛋白与DNA双链的亲和性,从而改变染色质的疏松和凝集状态,进而影响转录因子等调节蛋白与染色质的结合,影响基因表达。
3、非编码RNA调控
非编码RNA指不能翻译为蛋白质、但具有调控作用的功能性RNA分子,在调控基因表达过程中发挥着很大的作用。非编码RNA调控是通过某些机制实现对基因转录的调控,如RNA干扰等。
4、染色质重塑
染色质重塑是由染色质重塑复合物介导的一系列以染色质上核小体变化为基本特征的生物学过程,是一个重要的表观遗传学机制。
5、核小体定位
核小体是基因转录的障碍,被组蛋白紧密缠绕的DNA是无法与众多转录因子以及活化因子结合的。因此,核小体在基因组位置的改变对于调控基因表达有着重要影响。随着DNA复制、重组、修复以及转录控制等生命活动的开展,染色质上的核小体定位一直处于动态变化之中,这种不断的变化需要一系列染色质重塑复合体的作用。
四、表观遗传学与人类疾病
表观遗传学调控真核基因表达,其机制主要是在基因转录层面调控基因表达与人类重大疾病,如肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫性疾病的发生、发展密切相关,对表观遗传学进行广泛深入的研究,有利于充分认识疾病的病理机制,从而研发新的疾病治疗方法。
(一)DNA甲基化
所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下, 在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。正常情况下,人类基因组“ 垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少,并且总是处于甲基化状态,与之相反,人类基因组中大小为100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态,并且与56%的人类基因组编码基因相关。人类基因组序列图谱分析结果表明,人类基因组CpG岛约为28890个,大部分染色体每1 Mb就有5—15个CpG岛,平均值为每Mb含10.5个CpG岛,CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系, 特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题,DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。
(二)染色质重塑
染色质重塑复合物依靠水解ATP提供能量来完成染色质结构的改变,根据水解ATP的亚基不同,可将复合物分为SWI/SNF复合物、ISW复合物以及其它类型的复合物。这些复合物及相关的蛋白均与转录的激活和抑制、DNA的甲基化、DNA修复以及细胞周期相关。
ATRX、ERCC6、SMARCAL1均编码与SWI/SNF复合物相关的ATP酶。ATRX突变引起DNA甲基化异常导致数种遗传性的智力迟钝疾病如:X连锁α-地中海贫血综合征、Juberg-Marsidi综合征、Carpenter-Waziri综合征、Sutherland-Haan综合征和Smith-Fineman-Myers综合征,这些疾病与核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关。ERCC6的突变将导致Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal综合征和B型Cockayne综合征。前者表现为出生后发育异常、神经退行性变、进行性关节挛缩、夭折;后者表现出紫外线敏感、骨骼畸形、侏儒、神经退行性变等症状。这两种病对紫外诱导的DNA损伤缺乏修复能力,表明ERCC6蛋白在DNA修复中有重要的作用。SMARCAL1的突变导致Schimke免疫性骨质发育异常,表现为多向性T细胞免疫缺陷,临床症状表明SMARCAL1蛋白可能调控和细胞增殖相关的基因的表达。BRG1、SMARCB1和BRM编码SWI/SNF复合物特异的ATP酶,这些酶通过改变染色质的结构使成细胞纤维瘤蛋白(RB蛋白)顺利的行使调节细胞周期、抑制生长发育以及维持基因失活状态的功能,这三个基因的突变可导致肿瘤形成。
(三)DNA复制相关
组蛋白乙酰化与基因活化以及DNA复制相关,组蛋白的去乙酰化和基因的失活相关。乙酰化转移酶(HATs)主要是在组蛋白H3、H4的N端尾上的赖氨酸加上乙酰基,去乙酰化酶(HDACs)则相反,不同位置的修饰均需要特定的酶来完成。乙酰化酶家族可作为辅激活因子调控转录,调节细胞周期,参与DNA损伤修复,还可作为DNA结合蛋白。去乙酰化酶家族则和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周期、细胞分化和增殖以及细胞凋亡相关。
CREB结合蛋白(CBP)、E1A结合蛋白p300(EP300)和锌指蛋白220(ZNF220)均为乙酰化转移酶。CBP是cAMP应答元件结合蛋白的辅激活蛋白,通过乙酰化组蛋白使和cAMP应答元件作用的启动子开始转录,它的突变导致Rubinstein Taybi综合征,患者智力低下、面部畸形、拇指和拇趾粗大、身材矮小。CBP和EP300均可抑制肿瘤的形成,在小鼠瘤细胞中确定了CBP的突变,在结肠和乳房瘤细胞系中确定了EP300的突变,另外ZNF220异常和人的急性进行性髓性白血病相关。
如果突变导致错误的激活去乙酰化酶或错误的和去乙酰化酶相互作用,将可能导致疾病的发生。甲基化CpG-结合蛋白-2(MeCP2)可募集去乙酰化酶到甲基化的DNA区域,使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩,MeCP2的突变导致Rett综合征,患者出生即发病、智力发育迟缓、伴孤独症。若阻碍去乙酰化酶的功能,则可抑制癌细胞的增殖和分化,可用于急性早幼粒细胞性白血病, 急性淋巴细胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治疗。
染色质重塑异常引发的人类疾病是由于重塑复合物中的关键蛋白发生突变,导致染色质重塑失败,即核小体不能正确定位,并使修复DNA损伤的复合物,基础转录装置等不能接近DNA,从而影响基因的正常表达。如果突变导致抑癌基因或调节细胞周期的蛋白出现异常将导致癌症的发生。乙酰化酶的突变导致正常基因不能表达,去乙酰化酶的突变或一些和去乙酰化酶相关的蛋白的突变使去乙酰化酶错误募集将引发肿瘤等疾病。
(四)基因组印记
基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰,使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性,这种修饰常为DNA甲基化修饰,也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。在生殖细胞形成早期,来自父方和母方的印记将全部被消除,父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式,但在受精时这种甲基化模式还将发生改变;母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成,因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。发现的印记基因大约80%成簇,这些成簇的基因被位于同一条链上的顺式作用位点所调控,该位点被称做印记中心(IC)。印记基因的存在反映了性别的竞争,从发现的印记基因来看,父方对胚胎的贡献是加速其发育,而母方则是限制胚胎发育速度,亲代通过印记基因来影响其下一代,使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。
印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用,对行为和大脑的功能也有很大的影响,印记基因的异常同样可诱发癌症。
巨舌-巨人症综合征(BWS )患者表现为胚胎和胎盘过度增生,巨舌,巨大发育,儿童期易发生肿瘤。该病主要是由11号染色体上的IGF2和CDKN1C两个印记基因的错误表达引发,IGF2为父本表达的等位基因,CDKN1C为母本表达的等位基因。父本单亲二体型(UPDs)是引发BWS的主要原因,即IGF2基因双倍表达,CDKN1C基因不表达;次要原因是母本的CDKN1C等位基因发生突变;极少数病例是由于母本的染色体发生移位造成CDKN1C基因失活和(或)造成母本的IGF2基因表达。其它一些印记基因在胚胎发育过程中的过量或缺失表达也可导致类似于BWS的综合征,如原来母本表达的IPL基因的不表达或母本的ASCL2基因逃避印记都将导致胚胎的过度发育。这表明父本表达的等位基因对胚胎的生长有促进作用,而母本表达的等位基因对胚胎的发育起到限制作用。
Prader-Willi综合征(PWS)表现为肥胖、身材矮小和轻度智力发育迟缓;Angelman综合征(AS)表现为共济失调、过度活跃、严重智障、少语、表情愉悦,这两种疾病都和神经功能失调相关。PWS是由于突变导致父本印记基因在大脑中高表达所致,如SNPNP基因高表达;AS是由于母本的UBE3A基因的缺失或受到抑制所致,该基因编码泛素蛋白连接酶并在脑中表达。父本表达的SNRNP基因的微缺失可导致PWS,而在其上游进一步缺失则可导致AS,这说明这两个区域就是印记中心所在的位置。如果缺失父本染色体上的PWS印记中心将导致SNRNP基因以及附近的父本表达的等位基因被抑制,而缺失父本染色体上的AS印记中心则没什么变化,但若缺失母本染色体上的AS印记中心将导致UBE3A被抑制而导致AS。
印记基因丢失不仅影响胚胎发育,并可诱发出生后的发育异常,从而导致癌症发生。如果抑癌基因有活性的等位基因失活便提高了发生癌症的几率,例如IGF2基因印记丢失将导致多种肿瘤,如Wilm’s 瘤。与印记基因丢失相关的疾病还有成神经细胞瘤,急性早幼粒细胞性白血病,横纹肌肉瘤和散发的骨肉瘤等。
与基因组印记相关的疾病常常是由于印记丢失导致两个等位基因同时表达,或突变导致有活性的等位基因失活所致。调控基因簇的印记中心发生突变将导致一系列基因不表达,引发复杂综合征。基因组印记的本质仍为DNA修饰和蛋白修饰,所以与印记基因相关的蛋白发生突变也将导致表观遗传疾病。
(五)染色体失活
女性有两条X染色体,而男性只有一条X染色体,为了保持平衡,女性的一条X染色体被永久失活,这便是“剂量补偿”效应。哺乳动物雌性个体的X染色体失活遵循n-1法则,不论有多少条X染色体,最终只能随机保留一条的活性。对有多条X染色体的个体研究发现有活性的染色体比无活性的染色体提前复制,复制的异步性和LINE-1元件的非随机分布有可能揭示染色体失活的本质。哺乳动物受精以后,X染色体发生系统变化。首先父本X染色体(Xp)在所有的早期胚胎细胞中失活,表现为整个染色体的组蛋白被修饰和对细胞分裂有抑制作用的Pc-G蛋白(Pc-G)表达,然后Xp在内细胞群又选择性恢复活性,最后父本或母本X染色体再随机失活。
X染色体随机失活是X失活中心(Xic)调控的。Xic是一个顺式作用位点,包含辨别X染色体数目的信息和Xist基因,前者可保证仅有一条染色体有活性,但机制不明,后者缺失将导致X染色体失活失败。X染色体失活过程为:Xist基因编码Xist RNA,Xist RNA包裹在合成它的X染色体上,引发X染色体失活;随着Xist RNA在X染色体上的扩展,DNA甲基化和组蛋白的修饰马上发生,这对X染色体失活的建立和维持有重要的作用;失活的染色体依旧持续合成Xist RNA,维持本身的失活状态,但有活性的X染色体如何阻止Xist RNA的结合机制还不明确。
与X染色体失活相关的疾病多是由X染色体的不对称失活使携带有突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致。Wiskott-Aldrich综合征表现为免疫缺陷、湿疹、伴血小板缺乏症,该病是由于WASP基因突变所致。因为染色体随机失活导致女性为嵌合体,携带有50%的正常基因,通常无症状表现,该病患者多为男性。存在女性患病的原因在于不对称X染色体失活,即携带有正常WASP基因的染色体过多失活。但女性体内还存在另一种机制,通过不对称失活使携带有突变基因的X染色体大部分失活。对Pelizaeus-Merzbacher病的研究表明这种机制的存在,它使带有突变PLP基因的X染色体倾向于失活。RTT综合征也和不对称X染色体失活有关,携带有MeCP2突变基因的女性,X染色体失活时倾向于使携带有发生突变的等位基因的染色体失活。
即便是失活的X染色体,也有一部分基因可以逃避失活而存在两个有活性的等位基因,但逃避失活的等位基因的表达水平有很大的差异。由于逃避失活而易使一些抑癌基因丧失功能,这是引发女性癌症的一个重要原因。也有一些逃避失活的基因过量表达而增加某些疾病的易感性,如TIMP1基因随着年龄的增加表达量逐渐增加,导致迟发型疾病。女性易感的自身免疫性疾病也和X染色体失活相关,因为女性为嵌合体,如果自身免疫性T细胞不能耐受两个X染色体所编码的抗原,则会导致自身免疫缺陷性疾病,如红斑狼疮等。
(六)非编码RNA
功能性非编码RNA在基因表达中发挥重要的作用,按照它们的大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链非编码RNA在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用。在果蝇中调节“剂量补偿”的是roX RNA,该RNA还具有反式调节的作用,它和其它的蛋白共同构成MSL复合物,在雄性果蝇中调节X染色体活性。在哺乳动物中Xist RNA调节X染色体的失活,其具有特殊的模体可和一些蛋白共同作用实现X染色体的失活。Tsix RNA是Xist RNA的反义RNA,对Tsix起负调节作用,在X染色体随机失活中决定究竟哪条链失活。air RNA调节一个基因簇的表达,该基因簇含有3个调节生长的基因。长链RNA常在基因组中建立单等位基因表达模式,在核糖核蛋白复合物中充当催化中心,对染色质结构的改变发挥着重要的作用。
短链RNA在基因组水平对基因表达进行调控,其可介导mRNA的降解,诱导染色质结构的改变,决定着细胞的分化命运,还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。常见的短链RNA为小干涉RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA),前者是RNA干扰的主要执行者,后者也参与RNA干扰但有自己独立的作用机制。
非编码RNA对防止疾病发生有重要的作用。染色体着丝粒附近有大量的转座子,转座子可在染色体内部转座导致基因失活而引发多种疾病甚至癌症,然而在着丝粒区存在大量有活性的短链RNA,它们通过抑制转座子的转座而保护基因组的稳定性。在细胞分裂时,短链RNA异常将导致染色体无法在着丝粒处开始形成异染色质,细胞分裂异常,如果干细胞发生这种情况可能导致癌症的发生。siRNA 可在外来核酸的诱导下产生,通过RNA干扰清除外来的核酸,对预防传染病有重要的作用。RNA干扰已大量应用于疾病的研究为一些重大疾病的治疗带来了新的希望。
非编码RNA不仅能对整个染色体进行活性调节,也可对单个基因活性进行调节,它们对基因组的稳定性、细胞分裂、个体发育都有重要的作用。RNA干扰是研究人类疾病的重要手段,通过其它物质调节RNA干扰的效果以及实现RNA干扰在特异的组织中发挥作用是未来RNA干扰的研究重点。
五、获得性遗传与表观遗传的异同
获得性遗传是"后天获得性状遗传"的简称,是指生物在个体生活过程中,受外界环境条件的影响,产生带有适应意义和一定方向的性状变化,并能够遗传给后代的现象。由法国进化论者拉马克(C.Lamark)于19世纪提出。强调外界环境条件是生物发生变异的主要原因,并对生物进化有巨大推动作用。
如果获得性状可遗传,就可以进一步说明环境可引起遗传物质变异。生物学家已发现了不少获得性遗传的例项。例如,当用一种酶把枯草杆菌的细胞壁去除后,在特定的生长条件下,它们可以继续繁殖,后代也是无壁的,并且这种状态可以稳定地遗传下去,只有把它们放在另外的一种生长条件下,细胞壁才会重新生长出来。逆转录酶的发现,也证实了获得性是有遗传可能性的。“生命环境均衡论”的学者们认为:如果生活的环境条件改变了,生活也就发生改变,那么,动植物将采取适应其生活的性状,并且在这种性状永存的情况下,遗传因子也与之相应发生变化。但是必须经过地质时代这样漫长的时间单位。
越来越多的证据证明获得性是可遗传的,但并不能认为获得性遗传是生物进化的主要方式。因为在环境条件未发生剧烈变化的很长时期,生物进化的脚步并没有完全停止。生物进化是许多因素共同作用的结果,归根到底都必须是遗传物质发生了改变,只有这样变异才能一代一代延续下去。获得性遗传只强调了进化的外因。
六、表观遗传调控能否控制人类的衰老
衰老的程序可以被延迟或者逆转吗?日本筑波大学Jun-Ichi Hayashi教授领导的研究表明,在人类细胞系中,这种情况是有可能的。研究发现,控制甘氨酸表达的两个基因在一定程度上与一些衰老特征密切相关。 Hayashi教授和他的研究团队得出了这个令人振奋的发现,同时解答了衰老学说存在的一些争议。线粒体衰老学说强调与年龄相关的线粒体缺陷是由线粒体DNA突变累积控制的。线粒体功能异常是包括人类的许多物种衰老的标志,线粒体是细胞呼吸的主要场所,被称为“Powerhouse”。线粒体DNA损伤导致DNA序列突变,DNA突变的累积与寿命的减少和早发衰老特征(包括体重减轻、头发脱落、脊柱弯曲和骨质疏松症等)密切相关。然而,自相矛盾的结果越来越多,使人不得不怀疑这个理论的准确性。Tsukuba团队做了一个引人注目的研究,在这个研究中,他们得出了与衰老有关的线粒体缺陷并非由线粒体DNA突变累积控制的,而是受限于另外一种形式的基因调控。他们研究了年轻人(从胚胎期-12岁)和老年人(80-97岁)成纤维细胞的线粒体功能,比较这两组人的线粒体呼吸和线粒体DNA损伤的累积,他们预计的结果是老年人组细胞呼吸减少、DNA损伤累积增加。然而,和之前的理论一致,老年人的细胞呼吸下降了,但是DNA损伤的累积却和年轻人的没有差异。基于此,他们得出了与衰老有关的另外一种形式的基因调控,即表观遗传调控。表观遗传调控是指化学结构或者蛋白质的新增等导致DNA物理结构发生变化,从而开启或者关闭基因。与突变不同的是,这种变化不改变DNA序列。如果这个理论正确,那么将细胞改编到胚胎干细胞的状态就可以消除任何与线粒体DNA有关的表观遗传变异。为了验证这个理论,研究人员将年轻人和老年人的成纤维细胞重编到胚胎干细胞的状态,并将重编细胞放置到成纤维母细胞中,检测其线粒体的呼吸功能。令人难以置信的是,与衰老有关的线粒体缺陷竟可以被逆转。无论是年轻人还是老年人,重编后的成纤维细胞呼吸率与胎儿成纤维细胞呼吸率一致。这表明线粒体的衰老是由表观遗传调控,并非由DNA突变调控。研究人员随后寻找到了调控这些表观遗传的基因,并发现线粒体甘氨酸表达的两个调控基因(CGAT and SHMT2)。研究人员发现,通过改变这两个基因的调控,能够诱导或恢复成纤维细胞系的线粒体功能缺陷。还有个一个惊人的发现,在97岁老人的成纤维细胞中新增甘氨酸,10天后可恢复其细胞呼吸功能。这说明利用甘氨酸可以逆转老年人成纤维细胞中与衰老相关的功能缺陷。该研究表明,与线粒体衰老学说相比,在成纤维细胞中,与衰老相关的呼吸缺陷受表观遗传控制。但表观遗传调控是否能控制人类的衰老,还有待验证,如果被证实,那么通过甘氨酸的补充可以让老年人获得新生。
七、棕榈酸可引发癌细胞表观遗传改变
癌症的转移扩散仍然是癌症患者死亡的主要原因,绝大多数转移性癌症患者只能得到治疗,而无法治愈。科学家已经知道,我们饮食中的脂肪酸,即我们的身体和食物中脂肪的组成部分,会促进癌症转移。但目前学术界尚不清楚这一现象的机制,以及是否所有的脂肪酸都会促进癌症转移。该研究由英国慈善机构全球癌症研究提供部分资助,由西班牙巴塞罗那生物医学研究所(简称IRB研究所)领导。研究结果表明,棕榈油中常见的棕榈酸(一种脂肪酸)可促进小鼠口腔癌和黑色素瘤的转移。而其他存在于橄榄油和亚麻籽等食物中,被称为油酸(omega-9)和亚油酸(omega-6)的脂肪酸则不会产生这种影响。此外,所测试的脂肪酸都不会增加发生癌症的风险。
该研究发现,当在小鼠的饮食中补充棕榈酸时,它不仅会促进癌症转移,还会对基因组产生长期影响。即使从饮食中去除了棕榈酸,仅在短时间内接触过棕榈酸的癌细胞仍保持较强的转移能力。
研究人员发现,这种“记忆”是由表观遗传的变化引起的,这意味着基因功能的变化。表观遗传变化改变了转移性癌细胞的功能,使它们能够在肿瘤周围形成神经网络,与周围环境中的细胞进行交流,并更容易扩散。通过了解这种交流的性质,研究人员发现了一种阻止该过程的方法,现在他们正在规划一项临床试验,以阻止不同类型癌症的转移。
八、组蛋白甲基化
组蛋白的甲基化是发生在精氨酸和赖氨酸上的共价修饰作用,称之为组蛋白甲基化作用。精氨酸可以被单甲基化或双甲基化,而赖氨酸可以被单甲基化、双甲基化或三甲基化。负责组蛋白甲基化的酶类有三种,赖氨酸特异性SET结构域组蛋白甲基化酶,负责组蛋白H的4位(H3K4)、9位(H3K9)、27位(H3K27)赖氨酸及组蛋白H的20位赖氨酸的甲基化酶。
绝大多数组蛋白的共价修饰作用都是可逆的。LSDl是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,它可以去掉H3K4和H3K9的甲基化。随后,发现了JMD2家族、JARID1、Pad4等,它们分别使组蛋白不同位置的赖氨酸或精氨酸发生去甲基化。不同位点的甲基化及甲基化程度会引发不同的效应。组蛋白的甲基化标记可能与基因表达的激活、延伸或抑制有关。
组蛋白赖氨酸的甲基化在表观遗传调控中起着关键作用。组蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20均可被甲基化,是组蛋白赖氨酸甲基化的常发位点。组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化与基因的失活相关连;组蛋白H3第4位赖氨酸和第36位赖氨酸的甲基化与基因的激活相关连;组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化与同源盒基因沉默、X染色体失活、基因印记等基因沉默现象有关;组蛋白H3第79位赖氨酸的甲基化与防止基因失活和DNA修复有关。与此同时, 组蛋白的去甲基化也受到更为广泛的关注。
组蛋白去甲基化酶是可以脱去组蛋白甲基化的一类酶,主要有LSD1和JmjC家族去甲基化酶两类。
2004年,哈佛医学院的施扬教授发现了第一个组蛋白的去甲基化酶LSD1,在FAD的参与下,研究发现LSD1在体外可以特异去掉H3K4的二甲基和一甲基修饰,在体内则可以去掉H3K9的二甲基和一甲基修饰。LSD1是单胺氧化酶家族的一个成员,由于单胺氧化酶反应的过程中需要ε-N原子上一个额外的质子的参与,所以LSD1去甲基的活性受到底物的限制,不能去掉赖氨酸的三甲基修饰。
2006年,北卡罗来纳大学教堂山分校的张毅教授发现了一类含有JmjC结构域的去甲基化酶,JmjC家族去甲基化酶需要铁离子和a-酮戊二酸参与反应,可以去掉赖氨酸的三甲基化修饰。
组蛋白赖氨酸三甲基化的去除,可以相应的影响端粒的长度,是作为表观遗传修饰的重要途径,可能调控细胞增殖、机体衰老、肿瘤发生等重要生物学过程。
九、以LSD1为靶点的新型治疗剂
化学修饰是指凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白质或核酸共价结构发生改变的现象。化学修饰调节方式有别于别构调节,它以引起酶分子共价键的变化、化学结构的改变而影响酶活性。酶的化学修饰是在另一种酶的催化下完成的,是体内快速调节的另一种重要方式。化学修饰的方式包括磷酸化与去磷酸化、乙酰化与去乙酰化、甲基化与去甲基化、腺苷化与去腺苷化、-SH与-S-S-互变等,其中以磷酸化与去磷酸化、甲基化与去甲基化最为重要和常见。
2004年,哈佛医学院施扬课题组发现了第一个组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)。该课题组首次确认组蛋白甲基化是一个动态平衡过程,是一个可以逆转的组蛋白修饰。这一发现对组蛋白修饰的作用机制及其相应的药物研究提供了全新思路。LSD1是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的去甲基化酶,能够特异性地去除H3K4和H3K9位点上的单甲基化和二甲基化基团。LSD1参与调控受体介导的基因转录,并分别维持染色质的活性和非活性状态,从而调节组蛋白和其他蛋白的相互作用,并影响基因转录的激活、抑制和染色体失活等过程,被誉为细胞深处的基因“开关”。LSD1的功能失衡可引发多种重要生命现象的改变,是第一个真正意义上的组蛋白赖氨酸去甲基化酶,使人们认识到组蛋白甲基化是一个动态平衡的过程,通过组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的相互作用,动态地调控基因转录的激活和抑制等生物学过程,重新定义了组蛋白甲基化,同时也为进一步深入研究组蛋白修饰和相关药物研发提供了新的途径。
(一)LSD1的结构
LSD1含有852个氨基酸,晶体结构显示LSD1主要由三部分组成:N端的SWIRM (Swi3p/Rsc8p/Moira)结构域,C端的胺基氧化酶(AOL)结构域,该区域分为FAD结合结构域和底物结合结构域,两者组成催化活性中心,以及中心定位的Tower结构域。Tower结构域具有两条反向平衡的α螺旋,对LSD1的活性起重要的作用。LSD1是胺基氧化酶的同源蛋白,与多胺氧化酶(PAO)的相似度为22.4%,与单胺氧化酶A和B(MAO-A, MAO-B)的相似度为17.6%。
(二)LSD1催化反应机理
LSD1催化氧化反应时,要求胺基底物上必须有一个质子,因此其只能催化含有单甲基和双甲基的赖氨酸底物。LSD1与底物反应时,FAD从甲基化的组蛋白赖氨酸中得到质子,生成FADH2,甲基化的赖氨酸失去质子生成亚胺中间体,FADH2被氧化生成FAD和H2O2,亚胺中间体加水后生成胺基和甲醛。
LSD1主要通过以下3个途径来调节基因的表达:LSD1通过CoREST的SANT2结构域与靶基因结合,引起H3K4去甲基化,从而导致转录抑制;LSD1与雌激素/雄激素受体结合后,能使H3K9去甲基化,引起激素受体依赖的基因转录激活;LSD1通过对H3K4的去甲基化,使得DNA甲基转移酶(DNMTs)的正调控因子DNMT3L能够与未甲基化的K4位点结合,促进DNMTs的表达,引起DNA重新甲基化,从而导致基因转录抑制。
(三)LSD1的作用特性
在真核细胞中,DNA以染色体的形式存在,核小体是染色体的基本组成单位,由147bpDNA缠绕在以组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子为中心的八聚体上,每个核心组蛋白由一个折叠区和一个氨基末端结构域形成,其显著特征是易于被甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共价修饰。组蛋白的这些共价修饰大多是可逆的,如组蛋白的乙酰化、磷酸化和泛素化,以往认为组蛋白的甲基化修饰是一个不可逆的、永久性的组蛋白标记,直到2004年组蛋白去甲基化酶LSD1的发现,对这一观点提出了挑战,为进一步深入研究组蛋白修饰机制提供了新途径,也使基因调节过程更具动态性。
LSD1是一个FAD依赖性胺氧化酶,它能够特异性脱去单甲基化和二甲基化的组蛋白赖氨酸残基上的甲基基团。LSD1首先通过胺氧化反应氧化结合在底物上的-CH基团,形成一个亚胺中间产物,这个反应需要FAD参与。中间产物亚胺再被水解生成氯苯吡醇胺,这个基团不稳定,被降解后释放甲醛。LSD1只能脱去单甲基化或二甲基化的赖氨酸或精氨酸残基上的甲基基团,因为中间产物亚胺的形成需要一个质子化的氮,因而三甲基化的赖氨酸不能作为胺氧化酶的底物。
(四)LSD1对非组蛋白底物的作用
LSD1对非组蛋白底物p53和DNA甲基化酶(Dnmt1)的去甲基化作用,与组蛋白底物大有不同。LSD1使p53的C端二甲基化的K370位点去甲基化,去甲基化后的p53不能被共激活蛋白53BP1识别,降低了p53的活性,从而抑制p53靶基因的表达。可见,LSD1通过对p53去甲基化作用参与抑制p53介导的基因转录。此外,Set7/9等赖氨酸甲基化酶(KMT)使Dnmt1的K1096位点甲基化,从而促进Dnmt1蛋白降解;LSD1能够识别Dnmt1的K1096位点,使其去甲基化,并维持Dnmt1蛋白的稳定。LSD1对Dnmt1蛋白的去甲基化,并稳定Dnmt1蛋白不被降解,揭示了组蛋白和DNA甲基化相关联的新机制。
(五)LSD1参与基因转录调控的作用及表观遗传学机制
LSD1主要通过以下三个途径来调控基因的转录:
1、通过CoREST的SANT2结构域与靶基因结合,引起H3K4去甲基化,从而导致转录抑制;
2、LSD1与雄激素/雌激素受体结合后,能使H3K9去甲基化,引起激素受体依赖的基因转录激活;
3、LSD1通过对H3K4的去甲基化,使得DNA甲基转移酶(DNMTs)的正调控因子DNMT3L能够与未甲基化的K4位点结合,促进DNMTs的表达,引起DNA重新甲基化,从而导致基因转录抑制。
LSD1在基因表达调控中的作用取决于特异性底物,LSD1不同的分子伴侣介导LSD1作用于不同的底物,产生不同的生物学效应。研究表明,CoREST复合体中的LSD1作为转录复合抑制因子,能使组蛋白H3K4去甲基化,抑制一些神经元特异性基因的表达。应用RNAi沉默HeLa细胞LSD1后,发现这些神经元特异性基因启动子区LSD1显著减少,并伴随H3K4和基因的表达增加。在体内,LSD1存在于组蛋白去乙酰化酶复合物中,LSD1的组蛋白去甲基化酶活性受组蛋白去乙酰化酶的调节,抑制组蛋白去乙酰化活性后,LSD1的去甲基化酶活性也被抑制。例如,组蛋白去乙酰化酶HDAC1可以激活LSD1的活性,应用去乙酰化酶的抑制剂曲古菌素A抑制组蛋白去乙酰化活性后,LSD1的组蛋白去甲基化酶活性也被抑制,但是LSD1是如何被HDAC1的活性激活的还不清楚。
在体外,LSD1通常与CoREST、BHC80、HDAC存在于同一个组蛋白去乙酰化酶复合物中,称为共抑制复合物。CoREST与染色质结合后招募LSD1,并使其稳定,在非神经细胞中使其行使共抑制因子的功能,抑制神经细胞特异性基因的表达。BHC80蛋白的354~497位氨基酸区段可结合LSD1-CoREST复合体,使BHC80能够抑制LSD1的去甲基化酶活性,同时也能抑制细胞中LSD1-CoREST复合物的核小体去甲基化酶活性。另外,组蛋白H3尾部的共价修饰会影响LSD1的活性,组蛋白H3的过乙酰化能抑制LSD1的去甲基化酶的活性,H3K9的乙酰化能使LSD1的活性降低83.3%,组蛋白H3第10位丝氨酸(H3S10)的磷酸化也能使LSD1酶活性丧失。组蛋白H3上精氨酸(R)的甲基化对LSD1活性的影响依赖于精氨酸的位置,所以差异较大,H3R8的甲基化能使LSD1丧失全部活性,H3R2的甲基化能使LSD1的活性降低80%,而H3R17的甲基化对LSD1的活性影响较小。
LSD1介导的组蛋白去甲基化反应是一个逐步的、精细的、动态的调控过程,这其中有多个LSD1相关的正向和负向调节因子的参与,包括HDAC、CoREST和BHC80,这种动态调控对生理和病理情况下的基因表达水平有重要的影响。
(六)LSD1的生物学功能
研究证实LSD1不但通过使组蛋白去甲基化,还通过对非组蛋白p53和Dnmt1的去甲基化作用发挥其生物学功能。LSD1的生物学作用主要表现在对性激素受体介导基因转录的调控,对肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移的调节以及对胚胎发育、有丝分裂等的调节。
1、LSD1对性激素受体介导基因转录的调控
(1)LSD1对雄激素受体介导基因转录的调控
在人的前列腺癌细胞中,LSD1分别与雄激素受体(AR)的N端结构域、DNA结合结构域和配体结合结构域结合,并激活AR介导的基因转录,维持癌细胞的永生化特性。LSD1在AR的靶基因——前列腺特异性抗原(PSA)的启动子区域与AR形成复合物,使H3K9去甲基化,促进AR介导的靶基因的转录;但LSD1只能使H3K9Me和H3K9Me2去甲基化,不能使H3K9Me3去甲基化,还存在另一种去甲基化酶使H3K9Me3去甲基化,与LSD1协同作用,共同激活雄激素受体依赖的基因表达。应用RNAi敲除LSD1或应用胺氧化酶抑制剂—帕吉林能阻止LSD1对H3K9的去甲基化作用,使启动子区域的H3K9Me和H3K9Me2增加,均可抑制AR依赖的PSA基因表达和雄激素诱导的细胞增殖。AR以及LSD1在体内与含有JMJC结构域的去甲基化酶JMJD2C结合,LSD1与JMJD2C共同参与调控AR介导的基因转录。在细胞中,LSD1、AR和JMJD2C可在PSA基因的启动子区域形成功能复合物。共表达LSD1和JMJD2C能显著增强PSA基因的表达,而共表达LSD1和JMJD2C的失活突变体对PSA基因表达的激活作用明显减弱,RNAi介导的JMJD2C基因敲除也使雄激素受体介导的基因转录下调。
(2)LSD1对雌激素受体介导基因转录的调控
LSD1除调控AR功能外,还参与调控雌激素受体(ERα)介导的基因转录。ERα是维持女性生殖系统正常功能的重要调节因子,并且在乳腺癌的发生发展中起重要作用。LSD1与ERα结合后,通过使H3K4和H3K9去甲基化来调节其靶基因的表达。LSD1在哺乳动物的发育和许多生物过程中都发挥重要作用,并且与许多肿瘤的发生有关。此外,含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶JMJD2B也是雌激素信号转导途径中重要的组成部分,并在雌激素受体阳性的乳腺肿瘤中高表达。并且雌二醇以ERα依赖的形式诱导JMJD2B的表达,JMJD2B与ERα结合组成SWI/SNF-B染色体重塑复合物。JMJD2B被募集到ERα靶点,使H3K9Me3去甲基化,从而促进ERα靶基因的转录,当敲除JMJD2B时严重减弱雌激素诱导的细胞增殖和乳腺癌细胞形成肿瘤的能力。因此,JMJD2B也将成为乳腺癌治疗中的潜在靶标。
2、LSD1对肿瘤细胞增殖、凋亡和转移的调节作用
p53是与肿瘤关系最密切的肿瘤抑制基因,它在细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化和细胞凋亡中都起着重要的调节作用。LSD1可以直接与p53相互作用,来抑制p53介导的转录激活和促进细胞凋亡的作用。LSD1与p53的作用还可以抑制肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)的表达,当H3K4Me2去甲基化及抑制AFP转录时,p53和LSD1共同占有一个p53反应元素,且在H3K4Me2去甲基化的过程中,p53-LSD1复合物具有特异性。此外,LSD1还使p53羧基末端二甲基化的K370位点去甲基化,使得去甲基化后的K370位点不能被共激活蛋白53BP1的Tudor结构域识别,阻断p53信号通路的传递,调控着p53的生物学活性,导致细胞增殖失控。
LSD1是组成Mi-2/核小体重组和脱乙酰基酶复合物(NuRD)的核心成分。Wang等通过MDAMB-231细胞实验,说明了LSD1对于细胞本身增殖分化没有影响,但却影响侵袭潜能。LSD1/NuRD复合物可以锚定的区域包括与细胞生长、存活、转移、侵袭相关的多种基因的启动子,如E-cadherinsnail-slug-EMT以及肿瘤侵袭的关键信号通路TGF-β。体外实验研究发现,LSD1可遏制乳腺癌细胞的侵袭性,活体实验发现,LSD1可抑制乳腺癌细胞扩散转移,LSD1是TGF-β1的负调节模式。同时,在雌激素受体阴性的肿瘤中,LSD1水平很高,通过抑制LSD1水平可以使乳腺癌细胞的生长得到抑制。因此,LSD1将成为一个潜在的抗雌激素受体阴性的相关肿瘤治疗的靶标。
另外,人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性的限制性组分,端粒酶的激活是细胞永生化和恶性转化中普遍而特异的标志。最近发现hTERT基因在正常的纤维原细胞中不表达,而在肿瘤细胞,如宫颈癌HeLa细胞和肺癌A549细胞中过表达,应用胺氧化酶抑制剂—强内心百乐明抑制正常的纤维原细胞中LSD1的活性,发现hTERT基因表达上调,端粒酶活性增强,然而,LSD1如何调节hTERT基因表达以及对纤维原细胞生长增殖的影响,并不清楚。
在多种癌症的发生和发展的过程中,很多肿瘤抑制基因的表达被异常抑制。LSD1的抑制剂能使大肠癌细胞中这些被异常抑制的基因(SFRP1、SFRP4、SFRP5和GATA5)重新表达,从而诱发细胞凋亡,因此,LSD1的这些小分子抑制剂可能成为癌症治疗药物开发的有效靶点。现又发现LSD1与神经母细胞瘤分化密切相关;低分化的神经母细胞瘤中LSD1高表达,siRNA敲除LSD1后,瘤细胞的生长受抑制,体内实验证实抑制LSD1可以抑制神经母细胞瘤的生长。
3、LSD1对胚胎发育的调节作用
LSD1是一个母源性转录因子,卵细胞中LSD1的转录物在胚胎基因组激活(ZGA)过程中消失,然后在囊胚期又恢复到卵细胞中的转录水平。敲除果蝇胚胎中LSD1,引起组蛋白H3K4高度甲基化和基因表达异常,从而导致胚胎的死亡,还可引起H3K4甲基化失衡,导致果蝇不育和死亡。后来发现在小鼠胚胎发育过程中的原肠胚形成需要LSD1,应用LSD1的抑制剂—双联胍抑制LSD1活性后,小鼠胚胎的Oct4(POU5F1)基因表达上调,且胚胎的发育阻滞在4-细胞期,并且这种阻滞作用是不可逆的,提示LSD1可能在早期胚胎发育过程中起着重要的作用。LSD1在调控体细胞重编程过程中起重要作用。此外,组蛋白H3K9去甲基化酶JHDM2A和JMJD2C有维持小鼠胚胎干细胞全能性作用,RNAi敲除胚胎干细胞中JHDM2A和JMJD2C,发现Oct4、Sox2、Nanog等全能性因子表达下调,且胚胎干细胞表现分化特性,提示JHDM2A和JMJD2C可能通过去除H3K9的甲基化,激活Oct4、Sox2、Nanog等全能性因子,从而维持细胞的全能性。
研究发现线虫的LSD1通过重编程表观遗传记忆对生殖细胞的不死性起作用。线虫的spr-5(LSD1的线虫同源基因)突变会导致不孕,亲代的不孕性状可遗传给子代,且子代的不孕性状随着遗传代数的增加而加强,外源导入LSD1可恢复子代的不孕性状。spr-5突变导致的不孕是由于精子形成的相关基因位点上H3K4甲基化聚集所致基因调控异常导致的。该研究表明H3K4甲基化提供一种表观遗传记忆,LSD1在生殖细胞重编程这种记忆的过程中起重要作用。在垂体发育过程中,LSD1对细胞世系决定和分化起着重要的作用。LSD1在与PIT1蛋白结合后募集MLL3形成共激活复合物,激活PIT1靶基因Gh的转录。而当细胞开始表达ZEB1后,ZEB1能够募集LSD1-CoREST共抑制复合物到Gh基因启动子区,抑制Gh基因的表达。在垂体发育过程中,LSD1通过激活和抑制目的基因的转录,调节垂体细胞的分化。另有研究发现,斑马鱼胚胎中神经细胞的发育与LSD1有关。
4、LSD1对有丝分裂的调节作用
LSD1在细胞间期能够定位在中心体上,在细胞有丝分裂期定位在纺锤体两极。抑制LSD1的表达导致细胞在有丝分裂期染色体分离异常,同时,有丝分裂调控的核心蛋白MAD2和BubR1的水平下降。LSD1可以结合到MAD2和BubR1的启动子上并局部影响组蛋白H3K9的甲基化,是调控MAD2和BubR1启动子活性的阳性因子。研究提示LSD1可通过调节MAD2和BubR1转录活性来调控细胞有丝分裂期染色体的分离。
5、LSD1对TAL1功能和机体造血的调控
TAL1是机体造血过程中关键的转录因子,它的异常表达常导致T细胞白血病。在红细胞白血病和T细胞白血病细胞中,TAL1与含有LSD1、CoREST、HDAC1和HDAC2等蛋白成员的组蛋白去甲基化酶复合体相结合,且LSD1对组蛋白H3K4位点的去甲基化作用能抑制TAL1的转录活性。研究表明,在红系细胞分化的早期,与TAL1所结合的LSD1、HDAC1的蛋白量以及它们的酶活力都协同下调,只有在未分化的小鼠红细胞白血病细胞中,TAL1才促进LSD1结合到靶基因启动子区域,并抑制该基因的活性,而在分化状态时则不能抑制。应用shRNA技术下调小鼠红细胞白血病细胞中LSD1的表达,可提高靶基因位点组蛋白H3K4的二甲基化修饰水平,从而解除TAL1对下游靶基因的抑制。总之,LSD1以表观遗传修饰的方式负调控TAL1的转录;TAL1与LSD1/HDAC1复合体之间的动态调控,决定红系细胞分化的发生发展。
(七)LSD1作为抗肿瘤药物新靶点
利用RNA干扰技术和小分子LSD1抑制剂调节LSD1的表达量和活性,能够控制肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。同时,由于LSD1在多种肿瘤中高表达,与乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、口味癌、肺癌、神经母细胞瘤、白血病等密切相关,靶向LSD1的抗肿瘤治疗方案表现出较高的选择性和较低的毒副作用。因此,LSD1可能成为表观遗传学抗肿瘤药物的新靶点。
(八)LSD1与白血病
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积,并浸润其他非造血组织和器官,同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。
根据白血病的分化程度、自然病程的长短可分为急、慢性白血病。急性白血病细胞分化停滞在早期阶段,以原始及早幼细胞为主,疾病发展迅速,病程数月。慢性白血病细胞分化较好,以幼稚或成熟细胞为主,发展缓慢,病程数年。按病变细胞系列分类,包括髓系的粒、单、红、巨核系和淋巴系的T和B细胞系。临床上常将白血病分为淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病等。
儿童及青少年急性白血病多起病急骤。常见的首发症状包括发热、进行性贫血、显著的出血倾向或骨关节疼痛等。起病缓慢者以老年及部分青年病人居多,病情逐渐进展。此外,少数患者可以抽搐、失明、牙痛、牙龈肿胀、心包积液、双下肢截瘫等为首发症状。
LSD1在恶性造血系统中高表达,对于造血系统的分化具有重要的调控作用。在正常的造血系统分化过程中,造血干细胞分化为早期前祖细胞进而最终分化为成熟红细胞,任何时期所产生的突变均有可能导致恶性增殖的发生和发展。TAL1是早期造血干细胞特异性调控因子之一,它的异常表达会导致T细胞白血病的产生。LSD1的表达沉默抑制红细胞分化,而过量表达LSD1蛋白同样也抑制红细胞的分化,这说明LSD1在机体造血系统中发挥重要作用,无论是未分化的红细胞还是已分化的红细胞都需要LSD1的存在,提示LSD1可通过与红细胞特异性转录因子如TAL1或Gfilb相结合调控红细胞的分化。因此,LSD1以表观遗传修饰的方式调控TAL1的功能和机体造血系统。也正是TAL1-LSD1中蛋白质-蛋白质之间的相互作用,调节转录及基因表达,从而在机体造血系统及红细胞分化中发挥功能。
LSD1在多种人类急性髓系白血病(AML)中列于具有高度表达的基因中的5%,在AML生成过程中发挥重要的调控作用。LSD1的敲除会使AML细胞显著丧失白血病细胞无限增殖分化的潜能,不能形成克隆,在小模型中不会导致白血病的发生。由LSD1高表达介导的表观遗传修饰所导致的基因沉默,与疾病的发生发展密切相关,LSD1通过直接或间接的方式调控造血系统中一些重要转录因子和染色质重塑相关酶的表达,通过调控一系列基因表达进而激活MLL-AF9白血病相关癌基因。LSD1抑制剂会导致被异常沉默的抑癌基因获得激活从而重新表达。这些研究结果均表明在AML白血病中,LSD1所发挥的去甲基化功能与白血病相关的致癌基因具有密不可分的关系。鉴于这些重要发现,LSD1在调控基因表达及,MLL细胞分化过程中均发挥重要作用。
综上所述,LSD1在调控致癌基因的表达及造血系统生成、红细胞分化过程中发挥着重要作用,因而这一重要的表观遗传学调节因子可能成为白血病治疗中的重要靶标。
(九)LSD1抑制剂
LSD1能在多种肿瘤中高表达,是比较理想的抗肿瘤药物靶点。近年来的研究也证实LSD1抑制剂对多种肿瘤模型有效,并表现出对肿瘤细胞的高选择性。目前已有一些LSD1抑制剂已经进入临床试验阶段,但尚无批准上市的药物。以下对近几年发现报道的LSD1抑制剂进行归纳总结。
1、苯基环丙胺LSD1抑制剂
LSD1与单胺氧化酶是同源蛋白,因此单胺氧化酶(MAO)抑制剂被用来研究对LSD1的作用。Schule等发现MAO抑制剂苯基环丙胺对LSD1有比较弱的抑制作用。此外,MAO抑制剂优降宁也能够抑制LSD1的活性,但抑制率低、选择性差。机制研究发现,其结构中的苯基环丙胺通过和FAD共价结合抑制了LSD1的活性。此后,以苯基环丙胺为母核的大量衍生物陆续开发出来,是当前研究最多的一类LSD1抑制剂。此类抑制剂由于和FAD产生共价结合,因此不能排除对其他含有FAD酶的潜在作用的可能性。Mimasu等设计合成的苯基环丙胺类LSD1抑制剂可提高HEK293T细胞中H3K4二甲基化的水平。
西班牙OryzonGenomics公司开发了大量苯基环丙胺类LSD1抑制剂,其IC50分别为5nM、29~43nM和14nM。另有多个化合物处于临床前或临床试验阶段,其中ORY-1001于2013年8月获得EMA批准,作为治疗急性髓细胞白血病(AML)的孤儿药进行临床试验。GSK2879552是选择性不可逆LSD1抑制剂,在美国处于临床试验阶段,用于治疗复发性和难治性小细胞肺癌。
2、多胺类LSD1抑制剂
自2007年起,Huang课题组发现多胺类LSD1抑制剂能够明显抑制结肠癌细胞系HCT-116的活性,提高H3K4的单甲基化和二甲基化水平,并能诱导SFRP1、SFRP2、SFRP5和转录因子GATA5的重新表达。将其单用于接种了HCT-116的裸鼠,能够显著抑制肿瘤生长。2010年,该课题组Sharma等人又报道了一类多胺LSD1抑制剂,其中化合物11能够显著提高肺癌细胞系Calu-6的H3K4二甲基化水平,诱导SFRP2、SFRP5和转录因子GATA4的表达,显著抑制肿瘤的生长。Wang组研究发现可逆性多胺类LSD1抑制剂能抑制畸胎癌、胚胎癌等肿瘤干细胞的增殖。Balakrishna等设计合成了噁唑苯基LSD1抑制剂对宫颈癌HeLa细胞系和乳腺癌细胞MDA-MB-231有显著抑制效果。
3、多肽类LSD1抑制剂
Jeffery等根据LSD1的催化底物,设计并合成了赖氨酸衍生物,分别为时间依赖性抑制剂和非时间依赖性抑制剂。Isuru和Patrick设计并合成了线性和环状的多肽类LSD1抑制剂。与线性类似物相比,环状多肽类对蛋白水解酶更稳定,且在体内对乳腺癌MCF-7细胞和肺癌Calu-6细胞有抑制作用。
4、其他小分子LSD1抑制剂
2012年,Hazeldine等通过虚拟筛选获得了一类化合物,能够使结肠癌细胞系Calu-6的H3K4二甲基化水平升高,同时能诱导SFRP2、HCAD和GATA4等蛋白表达量升高。Namoline对LSD1有抑制作用,能阻止细胞增殖并抑制肿瘤增生。2013年,Hitchin等用基于片段的药物设计方法合成出全新的LSD1抑制剂,并报道该化合物是可逆的抑制剂,且该化合物在微摩尔浓度下没有细胞毒性。另一种化合物具有高效、特异性的LSD1抑制作用,但也有研究称其抑制作用源于较强的细胞毒性。Zheng报道了含三氮唑的LSD1抑制剂能够同时诱导细胞凋亡,并能抑制细胞转移和侵袭。
另外,还有人研究了三氮唑嘧啶类、二氢螺胺类、氰苯基嘧啶类、环丙茚胺类、吲哚类等LSD1抑制剂在抗肿瘤中的作用。
5、LSD1-JmjC双重抑制剂(泛-KDM抑制剂)
Rotili等将LSD1抑制剂苯基环丙胺和JmjC抑制剂酮戊二酸系列拼合,设计并合成了一系列对两组组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDM)均有抑制作用的化合物,能诱导前列腺癌LNCaP细胞和HCT116结肠癌细胞凋亡而对正常细胞没有影响,有选择性抑制肿瘤的作用。
(十)LSD1抑制剂与肿瘤
目前已经发现LSD1抑制剂对乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、口腔癌、食管鳞状上皮癌、神经胶质瘤等有显著抑制作用,在诸多肿瘤的发生、侵袭、转移及预后中扮演着极其重要的作用。
(十一)LSD1抑制剂与白血病
急性髓系白血病(AML)约占成人白血病的80%。目前,利用全反式维甲酸(ARTA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)已被证明有明显疗效。但除APL外,其他急性髓系白血病的治愈率仍然较低。
ORY-1001是由西班牙Orzyon公司研发的具有高选择性、强效(IC50<20nmol/L)的LSD1抑制剂,在推荐剂量有很好的耐受性,在64%的患者中对原始细胞分化有促进作用,能影响细胞多个基因的表达,使得白血病母细胞转变为正常分化的细胞,同时也降低了白血病干细胞的整殖和存活能力。
此外,RN-1、T-3775440、NCD25和NCD38 等更加高效、安全的LSD1抑制剂也在研发中,动物实验等结果表明其应用前景十分乐观。
研究发现,RN-1、GSK690对RUNX1-RUNX1T1(AML1-ETO)易位的白血病细胞最为敏感。RN-1与阿糖胞苷联用可有效降低AML细胞的生存能力,而组蛋白甲基化转移酶抑制剂EZH2与LSD1 抑制剂在AML等肿瘤治疗上也显示出协同作用,证实RN-1可有效诱导血红蛋白产生并减轻镰状红细胞病小鼠的症状。
最新研究显示,急性红细胞白血病(AEL)细胞和急性巨核细胞白血病(AMLK)细胞对T-3775440高度敏感,其机制可能与阻碍LSD1和独立生长因子1B之间的反应有关。NCD25和NCD38对多种白血病细胞和复杂核型的骨髓增生异常综合征(MDS)衍生细胞敏感,并可沉默具有超强激活LSD1作用的GFI1和ERG等基因。此外,NCD38还可在髓系分化前降低GFl1的表达,最终阻碍MDS和AML癌基因的进展。
十、展望
表观遗传学补充了“中心法则”忽略的两个问题,即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。决定表观遗传学过程的主要因素为DNA修饰、组蛋白修饰以及非编码RNA调控,这三个因素的相互关系以及它们如何共同来调节染色质结构还有待进一步的研究。在生命的历史中短链RNA可能充当着保护基因组稳定性的角色,且RNA对DNA甲基化和组蛋白修饰有指导作用,表明RNA可能和表观遗传改变的根本诱因相关,但真正的诱因目前还不清楚。对表观遗传中各种因子的突变导致的疾病的研究将有助我们了解表观遗传机制,进而指导疾病的治疗和新药的研制。
自从组蛋白去甲基化酶LSD1被发现后,其晶体结构、作用机制及生理功能的研究取得了较大的进展。LSD1参与的表观遗传修饰在多能干细胞的调控、机体造血系统、生殖发育等方面发挥着重要的生物学功能,为探索相关疾病的致病机理和治疗方法提供了实验和理论依据。
组蛋白甲基化与去甲基化失衡在肿瘤的发生发展中起重要作用,深刻认识并揭示其动态平衡机制,可能为疾病的防治寻找新的途径。体外实验显示,组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2可以激活LSD1的活性,但LSD1是如何被HDAC1/2的活性激活的;LSD1通常与CoREST、BHC80、HDAC形成共抑制复合物,BHC80能抑制LSD1的活性,BHC80是怎样结合LSD1-CoREST复合物,又是如何抑制LSD1的活性的;LSD1除了对组蛋白去甲基化作用外,还可对非组蛋白的蛋白(例如p53、Dnmt1)起去甲基化作用,从而参与调控p53及Dnmt1的作用,但LSD1调控Dnmt1的生物学功能仍有待进一步研究。
LSD1是肿瘤治疗药物开发的重要靶蛋白,调节组蛋白甲基化修饰将成为防治肿瘤的新思路和药物开发的新方向。目前已有部分LSD1抑制剂进入临床试验阶段,研发高效、低毒、高选择性的LSD1抑制剂是未来抗肿瘤药物,尤其是白血病治疗药物的研究方向之一。
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