依据《中药复方制剂整体质量评价体系的构建及应用》中关于构建中药复方制剂整体质量评价体系的技术路线，按照《达立通颗粒整体质量研究方案》，开展达立通颗粒整体质量评价研究，包括研发立项研究、组方和方解研究、中药材/饮片质量研究、生产过程控制技术研究、作用机制研究、质量标志物和生物标志物研究、循证医学研究、药物经济学研究。根据项目进展情况，我们将陆续报道相关研究成果。本期介绍达立通颗粒的HPLC指纹图谱研究及其化学成分分析研究成果。

摘要  目的：建立达立通颗粒的HPLC指纹图谱，并对达立通颗粒的化学成分进行鉴定。方法：采用Hypersil ODS-BP色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.05%乙酸溶液，梯度洗脱；检测波长为323nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为10μl。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度分析｡采用Triple TOF 5600+型检测器，运用ESI源分别在正、负模式下对达立通颗粒进行分析检测，并对达立通颗粒的12味原药材进行成分归属。结果：建立了达立通颗粒的HPLC指纹图谱，标定了16个共有峰，指证了其中4个共有峰分别为绿原酸、咖啡酸、芦丁和橙皮苷。10批达立通颗粒HPLC指纹图谱的相似度均大于0.990，通过LC-MS技术对达立通颗粒中的35个化学成分进行了鉴定。结论：该方法简单、快捷、稳定，可用于达立通颗粒的质量控制｡

达立通颗粒是由柴胡、枳实、木香、陈皮、清半夏、蒲公英、焦山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索和六神曲（炒）12味中药组成，具有清热解郁、和胃降逆、通利消滞的功效，用于治疗肝胃郁热所致痞满证。现代临床常用于治疗糖尿病胃轻瘫、慢性胃炎患者幽门螺旋杆菌感染、胆汁反流性胃炎等。达立通颗粒的化学成分复杂且难以分离，目前国内尚无关于其质量控制方面的文献报道，本试验采用LC-MS技术对其化学成分进行全面地分析与鉴定，并建立其指纹图谱，旨在为达立通颗粒的质量控制提供依据｡

1  仪器与材料

1.1  仪器  Agilent 1200型高效液相色谱仪（DAD检测器，美国安捷伦公司）；Triple TOF 5600+型高分辨飞行时间质谱联用仪（美国ABSCIEX公司）；BS214D型万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；MS105DU型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）｡

1.2  材料

（1）供试品

达立通颗粒（6g/袋），南昌弘益药业有限公司生产；经鉴定，达立通颗粒中的12味中药材均为正品。

（2）对照品

绿原酸、咖啡酸、芦丁和橙皮苷对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均≥98%。

（3）试剂

甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯｡

2  方法与结果

2.1  色谱条件

采用Hypersil  ODS-BP色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～10min，5%～12% A；10～40min，12%～25% A；40～75min，25%～60% A）；检测波长为323nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为10μl。

2.2  质谱条件

采用ESI离子源，在正、负离子模式下检测，扫描范围为m/z 50～1250；离子源温度为600℃；雾化气压力为50 psi；辅助气压力为50 psi；气帘气压力为35 psi；正、负离子模式离子扫描电压为5500V和-4500V｡

2.3  混合对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、芦丁和橙皮苷对照品2.01、0.98、10.00和4.98mg，置10ml量瓶中，加甲醇超声（250W，40 kHz）溶解，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得混合对照品溶液｡

2.4  供试品溶液的制备

称取达立通颗粒2g，研成粉末，精密称取0.2g，置10ml量瓶中，加90%甲醇适量，超声（250W，40kHz）30min，放冷，用90%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过｡取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液｡

2.5  方法学考察

2.5.1  精密度试验

取同一达立通颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图｡以同一橙皮苷色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.13%，相对峰面积的RSD为0.11%～2.15%，表明仪器精密度良好｡

2.5.2  稳定性试验

取同一达立通颗粒供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、16h按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图｡以同一橙皮苷色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.16%，相对峰面积的RSD为0.52%～2.31%，表明供试品溶液在16h内稳定性良好｡

2.5.3  重复性试验

取同一批达立通颗粒供试品，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图｡以同一橙皮苷色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.16%，相对峰面积的RSD为0.98%～2.18%，表明该方法重复性良好｡

2.6  指纹图谱研究

2.6.1  指纹图谱的建立及共有峰的筛选

通过与混合对照品色谱图比对，确定16个共有峰，指认了4个成分为绿原酸、咖啡酸、芦丁和橙皮苷｡由于橙皮苷色谱峰分离度较好，峰面积较大且出峰位置居中，故以橙皮苷色谱峰为参照峰。

2.6.2  相似度评价

取10批达立通颗粒供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图｡采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版本）”软件进行相似度评价，结果表明10批样品的相似度为0.992～1.000｡

2.6.3  聚类分析

利用SPSS 21.0数据分析软件进行系统聚类分析，将10批达立通颗粒共有峰的相对峰面积标准化后，采用组间联接法，利用欧式距离度量标准对10批样品进行聚类分析，结果表明，在生产线上抽取的达立通颗粒待包品特征峰与市售产品特征峰有一定的差异，包装对达立通颗粒的质量有一定影响。

2.7  成分归属

称取枳实、柴胡、木香、陈皮、清半夏、蒲公英、焦山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索、六神曲（炒）各100g，粉碎，过二号筛，分别取粉末0.2g，精密称定，按“2.4”项下方法制备各药材的供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，得到达立通颗12味中药材的HPLC色谱图｡

通过达立通颗粒HPLC指纹图谱与12味中药材的HPLC色谱图对比，归属了达立通颗粒HPLC指纹图谱中的16个共有峰｡16个共有峰均找到其相应的中药材药味归属，其中来源于中药材枳实和陈皮的共有峰最多。

2.8  LC-MS化学成分分析

按“2.2”项下质谱条件，分别在正、负离子模式下，对达立通颗粒供试品溶液进行扫描检测，通过各化合物的准分子离子峰确定其分子量和分子式，通过二级质谱裂解碎片，结合混合对照品色谱图和相关文献，对达立通颗粒的35个化学成分进行结构分析鉴定。

3  讨论

达立通颗粒HPLC指纹图谱中各色谱峰具有良好的分离度和对称性，表明本试验所建立的高效液相色谱法具有一定的可行性，适用于达立通颗粒HPLC指纹图谱数据的采集｡

10批达立通颗粒聚类分析结果表明达立通颗粒是否包装对其质量具有一定的影响｡成分归属研究表明，16个共有峰均找到其相应的药味归属，其中来源于药材陈皮和枳实的共有峰最多，表明陈皮和枳实对指纹图谱共有峰的贡献最大｡

达立通颗粒的LC-MS化学成分鉴定结果表明35个化合物大致分为五类，第一类为芦丁、橙皮苷、木犀草素、川陈皮素、槲皮素等黄酮类化合物，数量最多；第二类为原阿片碱、四氢药根碱、延胡索碱等生物碱类化合物；第三类为齐墩果酸、去氢木香内酯、木香烃内酯等萜类化合物；第四类为绿原酸、咖啡酸、奎尼酸等有机酸类化合物；其他化合物为一类｡由于达立通颗粒化学成分复杂，本试验鉴定的化合物只是其中的一部分，其余化学成分的鉴定有待进一步深入研究｡

综上，本试验所建立的HPLC指纹图谱研究方法简便可靠，可为达立通颗粒的质量控制提供科学依据｡

 

文献资料

1、肖飞等，达立通颗粒的HPLC指纹图谱研究及其LC-MS化学成分分析，中药材，2019，42（4）：828～834

2、国家药品监督管理局，关于加强中药注册管理有关事宜的通知（国药管注［2000］157号）

3、国家药品监督管理局，

中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）（2000年）

4、国家药典委员会，中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012.0版

 

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