采用UPLC-Q-TOF/MS/MS对达立通颗粒体内外化学成分进行分析,非目标特征滤波器分析并结合计
发布时间:2022-10-11 15:46:00 | 来源:【药物研发团队 2022-10-11】
采用UPLC-Q-TOF/MS/MS对达立通颗粒体内外化学成分进行分析,非目标特征滤波器分析并结合计算机预测策略对其化学成分和体内代谢物进行鉴定
Yan Su,Lin Tao,Xiaoli Zhang,Xianjie Sheng,Qin Li,Wenying Fei,Tao Yin,An Kang,Jiye Aa,Guangji Wang
PII:S0731-7085(22)00507-6
DOI:https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
引用:PBA115086
引用出处:Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
接收日期:2022.05.17
修正日期:2022.09.24
接受日期:2022.09.27
引用本文为:Yan Su,Lin Tao,Xiaoli Zhang,Xianjie Sheng,Qin Li,Wenying Fei,Tao Yin,An Kang,Jiye Aa,Guangji Wang,《达立通颗粒体内外化学成分的超高效液相色谱-Q-TOF/MS/MS分析方法及其在体内代谢产物的研究》,《医药与生物医学分析杂志》,(2022)doi:https://doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
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采用 UPLC-Q-TOF/MS/MS对达立通颗粒体内外化学成分进行分析,非目标特征滤波器分析并结合计算机预测策略对其化学成分和体内代谢物进行鉴定
Yan Su1,Lin Tao2,Xiaoli Zhang2,Xianjie Sheng1,Qin Li1,Wenying Fei1,Tao Yin1,An Kang1*,Jiye Aa3**,Guangji Wang3
1.南京中医药大学药学院,江苏南京210023;
2.南昌弘益药业有限公司,南昌330006;
3.中国药科大学代谢组学实验室,江苏省药物代谢与药代动力学重点实验室,江苏南京210009
页眉标题:达立通颗粒体内外化学成分分析
通讯作者:
*An Kang:南京中医药大学药学院,南京仙林大道138号,210023,中国,Email:kanga@njucm.edu.cn
** Jiye Aa:中国药科大学药物代谢与药代动力学重点实验室,南京佟家巷24号,南京210009,中国,Email:jiyea@cpu.edu.cn
摘要
达立通颗粒,作为一种强效胃肠动力中药,临床上用于治疗功能性消化不良。对缓解胃肠动力障碍有较好的疗效,具有广阔的临床应用前景。然而,目前对其体内外化学分析还没有全面的研究。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS结合非靶向特征过滤分析和计算机预测策略(NCFS),推导和鉴别大鼠口服达立通颗粒后生物样品中的化学成分和体内代谢产物。本研究从达立通颗粒中鉴定出108种化学成分,其中黄酮类化合物50种,生物碱22种,萜类13种,有机酸11种,香豆素10种,挥发油2种。在大鼠给药后的血浆、组织、尿液和粪便样本中,共推测出147个化合物(60个原型化合物,87个代谢物)。体内代谢途径主要有甲基化、去甲基化、去糖基化、氢化、羟基化、磺化、葡糖苷醛化等。总之,达立通颗粒中存在大量的黄酮类化合物。综上所述,采用快速、准确的分析方法对达立通颗粒的化学成分和代谢物进行了全面的鉴定,为其生物活性物质的分析奠定了基础。为深入研究达立通颗粒药效的物质基础及进一步综合开发利用提供了科学依据。
关键词:达立通颗粒,化学成分,代谢物,高分辨质谱
1.引言
胃弱又称消化不良,已经越来越普遍了,可分为两类:“器质性”消化不良和功能性消化不良(FD)[1]。FD是临床常见的功能性胃肠疾病,是指以胃脘痛、餐后加重的胃脘胀、早饱、嗳气、食欲不振、恶心、呕吐等消化不良症状的疾病[2,3]。达立通颗粒是由柴胡、枳实、木香、陈皮、清半夏、蒲公英、山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索、六神曲12种中药材组成[4],是目前应用最广泛的促胃肠动力中药之一。柴胡是达立通颗粒的主药,主要治疗胃肠气和饮食积累,可改善功能性消化不良患者的临床症状。枳实具有化气清积、化痰祛斑的作用[5];木香能止痛,用于胃脾气郁滞引起的腹胀、嗳气、食欲不振等症状[6];陈皮、槟榔子、山楂、延胡索具有降逆气、和胃、消滞的作用[7,8]。
临床研究结果表明,与化学药物多潘立酮和西沙必利相比,达立通颗粒具有促进胃排空、肠运动、止吐和镇痛的作用。目前,达立通通联合其他方法治疗胃肠疾病的报道较多,但对其化学成分分析和鉴定的综合报道较少。因此,建立达立通颗粒化学成分和代谢物的综合研究方法是很有必要的。
在UPLC-Q-TOF-MS分析之后,我们可以使用非靶向特征过滤分析和在计算机预测策略(NCFS)中有效地识别中药和生物样品中可能存在的化学物质和代谢产物。非靶向特征滤波器分析是多重质量缺陷滤波器(MMDF)、片段和中性损失滤波器(FNLF)、诊断片段离子滤波器(DFIF)、产物离子滤波器(PIF)、氮规则滤波器(NRF)的统称,而在计算机预测策略中需要使用三个数据库来预测代谢物:BioTransformer(http://biotransformer.ca/new)、GLORYx (https://nerdd.univie.ac.at/)和EAWAGPPS (http://eawag-bbd.ethz.ch/)[9,10]。该整合策略具有高灵敏度、高精度和高分辨率的特点,可用于大鼠给药后不同生物样品中原型及其代谢物的成分分析。研究达立通颗粒的体内外化学成分及可能的代谢物,为深入研究达立通颗粒的物质基础提供科学依据,促进其现代化发展。
2.实验
2.1.材料和试剂
甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)(HPLC级)购自默克公司(Darmstadt,Germany),甲酸(FA)(LC-MS级)购自Aladdin (Shanghai,China)。使用Milli-Q系统(Millipore,Bedford,MA,USA)进行超纯水净化。达立通颗粒(批号:210342)由南昌弘益药业有限公司生产、提供。
Saikosaponin A和Saikosaponin D来自Mansite生物技术有限公司(中国成都)。槟榔碱、绿原酸、阿曲柳苷、原儿茶酸、鸡皮苷、黄连碱、麻瓜碱、巴马汀、黄连素、原托碱、伞形花酮、牡荆素4”-o-葡萄糖苷、金菊素、异绿原酸B、二氢车菊碱均来自成都普飞德生物科技有限公司。橙皮苷、木犀草素、芹菜素购自上海源业生物科技有限公司。槲皮素、芦丁购自中国食品药品检定研究院,1-咖啡酰奎宁酸、大麦芽碱、咖啡酸、金丝桃苷、阿魏酸、聚氰胺糖苷、甲基橙皮苷、橙皮苷、木质素内酯、去氢木香内酯、花青素,柠檬素、山柰素、橙皮素、黄芩苷、山奈酚、四氢巴马汀、柚皮苷、奥拉蓬素购自中国成都中草药有限公司。
2.2.仪器和UPLC条件
UPLC-Q-TOF/MS/MS(AB SCIEX)分析系统由UPLC系统(LC-20A,Shimadzu)耦合到配备电子喷雾电离(ESI)的四极杆飞行时间质谱仪(AB SCIEX)组成。采用Hypersil GOLDTM色谱柱(3 m,2.1 mm 100 mm),柱温40℃,流速0.4 mL/min。流动相A为水和FA(0.1%, v/v),流动相B为乙腈。洗脱过程按以下梯度进行:0-2分钟,5% B;2-25分钟,60% B;25-28分钟,90% B;28-30分钟,90% B;30-32分钟,5% B;32-36分钟,0。进样量为3 μL。
质谱参数设置如下:正离子/负离子模式下扫描范围均为m/z 50- 1500。帷幕气(GUR)为40 psi;雾化气体(GS1)和辅助气体(GS2)均为55 psi;离子喷雾电压设置为5500 V/-5500 V;碰撞能量为10 V或-10 V;去簇电压为100 V/-100 V;ESI温度为550℃。
2.3.达立通颗粒的萃取
取达立通颗粒2.875 g,相当于药材5 g,加入80%甲醇10 mL,振荡30 min,离心10min,取上清液。用真空离心浓缩器(Thermo Scientific)将上清液在45℃下干燥,残渣在800 μL甲醇中重新溶解,确保最终浓度为6.25 g粗品/mL。
2.4.动物和给药
雄性SD大鼠8只(180~220g),由杭州医学院(中国浙江)提供。实验动物许可证编号为SYXK(浙)-2019-0002。所有动物治疗均根据美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行。动物研究方案经南京中医药大学期刊动物伦理委员会预审通过。
这些大鼠被安置在标准条件下(室温22±2℃;相对湿度55±5%;并在一周内进行12小时的明暗交替循环),允许自由进食和饮水。根据实验需要,给药前将大鼠随机分为两组(n = 4/组),对照组和达立通颗粒治疗组。达立通颗粒治疗组取2只大鼠血浆样本,另取2只大鼠尿、粪样本。每天灌胃1次(上午8:30均匀灌胃),按11.2 g/kg生药(约为临床剂量的4倍)灌胃7天,有利于大鼠生物样本中发现更多吸收的原型物和代谢物。同时,对照组大鼠灌胃等量水。
2.5.样品预处理
在最后一次给药后的0.5、1、2、4、6、8 h,用肝素化离心管采集眼静脉血液样本。在5000 rpm离心10 min后收集上清液,将0.5 h和1 h、2 h和4 h、6 h和8 h的上清组合液为血浆1(P1)、血浆2(P2)和血浆3(P3)。不同时期的血浆样本采集和组合的目的是检测出更多的血浆原型和代谢物。加入3倍乙腈沉淀血浆中的蛋白质后,上清液蒸发至干燥,加入200 μL甲醇溶解残渣。最后,在4℃,12,000 rpm离心10分钟,将上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系统。
末次给药(等剂量水)后,将两组大鼠分别放入代谢笼中收集尿液和粪便。将尿样与超纯水按1:1混合,共3ml,5000转离心10分钟,取上清液。将上清液蒸发至干燥,再加入200 μL甲醇溶解残渣。最后,在4℃,12,000 rpm离心10分钟,将上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系统。
粪便样品,将0.2 g粪便加入0.8 mL 80%乙腈中,旋涡10分钟,以5000转/分离心10分钟,得到上清液。上清液蒸发至干,用200 μL甲醇溶解残液。最后,在4℃,12,000 rpm离心10分钟,将上清注入UPLC-Q-TOF-MS系统。
同样的,采集大鼠的胃、肝、肾、空肠和结肠。2 mL EP管中各取0.2 g,加入0.8mL 80%乙腈研磨成匀浆。离心后收集上清液并干燥,加入200 μL甲醇溶解。12000 rpm离心10 min后收集上清,注入UPLC-Q-TOF-MS系统。
3.结果与讨论
3.1达立通颗粒化学成分的鉴定
UPLC-Q-TOF-MS/MS分析系统结合非靶向特征滤波分析和计算机预测策略(NCFS)的化学成分体内外鉴定主要包括四个步骤,具体信息见图1[11,12]。首先,采用UPLCQ-TOF-MS进行数据采集;与信息依赖采集(IDA)测试相对应的结合动态背景减法(DBS)设置的在线数据采集方法,能够高效、灵敏地区分背景干扰离子和目标离子[13,14]。通过上述步骤,结合文献和TCMSP数据库[15],建立了包含保留时间、主要片段离子等多种质谱信息的达立通颗粒化学成分数据库。其次,在PeakView software aretm TM(AB SCIEX)应用的基础上,总结了主要参考物质的破碎规律。采用离子色谱(XIC)提取和质谱特征过滤功能,包括片段和中性损失过滤器(FNLF)、诊断片段离子过滤器(DFIF)、产物离子过滤器(PIF)和氮规则过滤器(NRF),对采集的质谱数据[16]进行分析。该步骤可以提供准确的MS2信息,以快速有效地筛选目标化合物并推测目标化合物的部分代谢物。第三步,利用BioTransformer、GLORYx和EAWAG-PPS[17]对达立通颗粒的代谢物进行预测。利用Peakview SoftwareTM(AB SCIEX)对不同生物样品的质谱数据进行分析,结合文献报道,采用多重质量缺陷滤波(MMDF)、片段和中性损失滤波(FNLF)、诊断片段离子滤波(DFIF)、产物离子滤波(PIF)和氮规则滤波(NRF)策略。并利用上述步骤中发现的原型物质的破碎规律和大鼠口服达立通颗粒后产生的代谢物进行初步鉴定。最后,在文献报道的基础上,结合上述鉴定的原型和代谢物,对达立通颗粒中不同类型化学成分的代谢途径进行总结[18-20]。
达立通颗粒中鉴定出的化学成分及相关质谱数据见表S1。在达立通颗粒中共检出108种化合物,其中类黄酮50种,生物碱22种,萜类13种,有机酸11种,香豆素10种,挥发油2种。其中43个化合物通过与对照物的保留时间和主要片段离子的比较,进一步得到了明确的确认。达立通颗粒在正离子(A)和负离子(B)模式下的基峰色谱(BPC)如图2所示。达立通颗粒的一般化学结构配方分类如图3所示。图4为达立通颗粒中四种典型化合物(柚皮苷4’-葡萄糖苷、氢化小檗碱、鸡矢藤甙酸和奎宁酸)的提取离子色谱图、MS/MS光谱和解理图,对其代谢产物的推测和验证具有重要意义。
3.1.1类黄酮
采用UPLC-Q-TOF-MS 法测定达立通颗粒中黄酮类化合物含量为20种。而本研究通过PIF、FNLF和DFIF策略,发现并鉴定了50种黄酮类化合物,包括黄酮苷元、黄酮O-糖苷和黄酮C-糖苷[21]。黄酮苷元的裂解模式主要有两大类。类黄酮C环上典型的反向- diels -alder(RDA)反应可产生诊断离子。通过比较化合物的产物离子和诊断离子的元素差异,推测类黄酮取代基的位置和类型。此外,中性分子(CH3、CO和CO2)的丢失可以产生识别化合物[22]的特征产物离子。例如,甲烷的丢失是甲氧基黄酮类化合物的特征。除了上述两种主要的裂解模式外,黄酮O-糖苷还可以通过失去糖苷键产生片段离子。146 Da、162 Da和176 Da的丢失表明分别存在O-鼠李糖(Rha)O-糖苷(Glc)和葡萄糖醛酸酯(Glu)[23]。此外,O-糖基黄酮的片段离子主要由糖环的裂解产生,包括中性片段(90 Da、150 Da)的丢失和诊断离子片段(120 Da)的丢失。因此,黄酮O苷和黄酮C苷可以通过不同的片段离子来区分。
化合物43(C27H32O14,tR=9.115 min)的光谱显示为m/z 581.1855 [M+H]+准分子离子,产物离子m/z 435.1292 [M+H- Rha]+,273.0756 [M+H- Rha - Glc]+和诊断离子153.0184 [M+H- Rha - Glc - C8H8O]+。化合物49(C27H32O14,tR=9.408 min)产生一个m/z 581.1856 [M+H]+的准分子离子,在MS2中检测到诊断离子m/z 273 [M+H- Rha -Glc]+。这两种化合物的片段离子基本是相同的[24]。结合文献报道,柚皮苷芸香苷是一种与柚皮苷苷元连接的芸香苷,它更倾向于去除末端的鼠李糖的一个分子,与葡萄糖残基生成苷元离子m/z 435。因此,m/ z435离子片段的相对丰度较高;柚苷是一种与柚皮苷苷元连接的新橙皮糖。同时容易去除双糖,因此m/ z273离子片段相对丰度较高。因此,推测C43为柚皮芸香苷, C49为柚苷。
化合物30(C33H42O19,tR=7.946 min)(图4a)在m/z 743.2404 [M+H]+和m/z 741.2240 [M-H]-处分别为准分子离子。产物离子在m/z 435.1278 [M+H-Glc-Rha]+,417.1170 [M+H-Glc - Rha- H2O]+和诊断离子273.0755 [M+H-2Glc-Rha]+、153.0176(1,3A -)[M+H-2Glc-Rha-C8H8O]+以正离子模式存在,片段离子M /z 621.1672 [M- H]-和诊断离子M /z 271.0591 [M-H-2Glc-Rha]-、151.0029(1,3A-) [M-H-2Glc-Rha-C8H8O]-以负离子模式存在。因此,推测C30为柚皮芸香苷 4 -葡萄糖苷[24]。化合物53 (C28H34O15,tR=9.646 min)为m/z 611.1961 [M+H]+的准分子离子。检测到的片段离子为m/z 465.1387 [M+H- Rha]+、303.0862 [M+H - Rha - Glc]+、177.0550 [M+H - Rha - Glc-C6H6O3]+、153.0187 [M+H-Rha-Glc- C9H10O2]+(诊断离子)。将C53与对照物的片段信息进行比对,鉴定为橙皮苷[25]。
化合物79(C15H10O5,tR=12.986 min)表现为m/z 271.0600 [M+H]+的准分子离子。产物离子位于m/z 243.0603 [M+H-CO]+、153.0176 [M+H-C8H6O]+ (1,3A-)(诊断离子)和119.0502 [M+H-C7H4O4]+ (1,3B -)(互补片段离子),这是黄酮类化合物C环X1,3裂解产生的特征离子片段。这意味着在A环上有两个羟基取代,在B环上有一个羟基取代。通过与对照物的片段信息比较,C79被鉴定为芹菜素[24]。
3.1.2.生物碱类
本研究从达立通颗粒提取液中鉴定出23种生物碱和其他含氮化合物,主要来自延胡索和鸡矢藤。氮规则是指不含氮或偶氮的有机质相对分子质量为偶,含奇氮的有机质相对分子质量为奇,可用于质谱数据的过滤。根据氮规则,有些生物碱更容易生成一个易于检测的准分子离子[M]+,有些生物碱在正离子模式下生成一个准分子离子[M+H]+,而失去含氮基团。此外,PIF、DFIF和FNLF策略仍然适用于生物碱的鉴定。化合物1(C8H13NO2,tR=0.953 min)在m/z 156.1019[M+H]+处生成准分子离子。产物离子在m/z 138.0570 [M+H-H2O]+,124.0753 [M +H-OCH3]+和1313.0584[M + H-C2H6N] +被发现。因此,通过与对照物的片段信息比较,推断C1为槟榔碱。化合物57 (C20H21NO4,tR=9.906 min)(图4b)为m/z 340.1544 [M+H]+的准分子离子。176.0712 [M+H-C10H12O2]+(丰度最高的片段离子和诊断离子)、165.0914 [M+H-C10H9NO2]+(互补片段离子)和149.0607 [M+HC11H13NO2]+的产物离子证实了典型的RDA-解离特征,这是由于苯甲酰氧基和含氮基团的连续丢失。通过与对照物的片段信息比较,确定其为氢化小檗碱。
3.1.3.萜类
本研究从达立通颗粒中鉴定出13个萜类化合物,包括倍半萜、环烯醚萜和三萜皂苷(五环三萜苷)。鸡矢藤的主要成分是萜类化合物,如芍药苷、单肌豆苷、曲柳苷和芍药苷酸(图4c)等。部分萜类化合物优先失去中性的小分子,包括H2O、CO2、CH3和CO,部分皂苷会先失去糖苷变成小分子。146 Da和162 Da的丢失表明O-焦点和O-糖苷的存在。因此,利用FNLF和PIF的策略可以对萜类[26]进行过滤和识别。如C2、C23、C104和C105为萜类化合物,其特征片段表现为CO2和H2O的中性损失。化合物2(C16H22O11,tR=1.146 min)在m/z 389.1088 [M-H]-范围内生成准分子离子。在MS2中可以检测到m/z 227.0545 [M-H -Glc]-、209.0439 [M-H-Glc-H2O]-、191.0334 [M-H-Glc-2H2O]-、183.0654 [M-H-Glc -CO2]-、179.0551 [M- H- Glc - CH4O2]-、165.0548 [M-H-Glc - C2H6O2]-、147.0447 [M-H-Glc - 2H2O]-处的产物离子。结合文献报道,C2被鉴定为水晶兰苷。木香内酯(化合物104,C15H20O2,tR=20.345 min)和去氢木香内酯(化合物105,C15H18O2,tR=20.734 min)是木香的主要成分,也属于萜类化合物。以前者为例,C104在m/z 233.1533 [M +H]+处产生了一个准分子离子,发现特征片段m/z 215.1408 [M+H- H2O]+和m/z 187.1476 [M+H-CO2-2H]+ 这是由丢失的水(18 Da)、二氧化碳和2H (46 Da)产生的。推测C104为木质素内酯,并通过与对照物的片段信息对比进一步证实了这一点。
柴胡皂苷是柴胡的主要成分,属于β-芳香树脂烷基三萜。62 Da和58 Da的损失分别代表C2H6O2和C2H2O2的损失。因此,PIF、FNLF和DFIF策略同样适用于柴胡皂苷[27]的鉴定。化合物103 (C44H70O14,tR=19.836 min)的m/z为821.4697 [M - H]-。在MS2中检测到产物离子m/z为779.4620 [M-H-C2H2O]-、617.4080 [M-H - Glc - C2H2O]-和471.3490 [M-H- Glc - Fuc - C2H2O]-(诊断离子)。通过与对照物的片段信息比较,推测C103为3”- O -乙酰柴胡皂苷D [28]。
3.1.4.有机酸
采用FNLF和PIF方法,在达立通颗粒提取液中分离出11种有机酸化合物。中药山楂的主要成分为有机酸,如绿原酸、咖啡酸、齐墩果酸、奎宁酸等(图4d)。这些化合物在负离子模式下更容易被检测到,主要是H2O、CO2和CH3等小分子碎片的丢失。化合物5 (C7H6O4,tR=1.877 min)为[M-H]-准分子离子,m/z为153.0199。在m/z 109.0302 [M-H-CO2]-, 108.0215 [M-H-HCOO]-和91.0194 [M- H- CO2 - H2O]-处发现了产物离子。因此,推测C5为原儿茶酸。
3.1.5.香豆素
从达立通颗粒中鉴定出10种香豆素。这些化合物主要从中药枳实和山楂中分离得到,包括枳酚、伞形花酮、东莨菪素、枳烯、环氧枳烯和黄当归醇。化合物71 (C17H16O6,tR=11.374 min)在M /z 317.1020处有一个[M+H]+的准分子离子,该离子裂解后失去C7H10O2(126 Da),生成片段M /z 191.0701,失去C9H8O3 (164 Da),得到特征片段M /z 153.0176。通过与文献报道的片段信息对比,推测化合物71为甜菊糖。
化合物78(C19H22O4,tR=12.588 min)在M /z 315.1593处有一个[M+H]+准分子离子,通过母离子裂解损失的C9H16O (140 Da)、C10H16O(152 Da)和C9H6O3(162 Da)得到M /z 175.0366、163.0385和153.1271处的特征片段离子。比较片段信息,推测C78为环氧枳烯。
3.1.6.其他化合物
质谱分析结果表明,达立通颗粒提取液中含有两种挥发油化合物。化合物87 (C10H14,tR=14.608 min)为[M+H]+准分子离子,M/z为135.1167。m/z为91.0556 [M+H-C3H8]+和77.0403 [M+H-C4H10]+的片段离子,结合文献报道,推测C87为p-伞花烃。
3.2.体内吸收成分和代谢物的鉴定
首先,以达立通颗粒提取液的鉴定结果为基础,采用XIC法对大鼠吸收的原型化合物进行鉴定;接下来,在计算机代谢物预测中预测吸收的原型化合物的潜在代谢物,包括BioTransformer、gloria和EAWAG-PPS[10]。前两者可以预测I相和II相代谢的产物,最后一个可以预测化合物可能的生物降解,包括常见的代谢转化。采用PeakView SoftwareTM和XIC软件对预测的代谢物进行识别,并与原型和文献进行比较,确定的准确质量、保留时间和片段离子,采用MMDF、DFIF、PIF和FNLF策略进行筛选。最后,推导出可能的代谢途径[29]。
通过上述步骤,在生物信息学预测中总共预测了978种可能的代谢物。然后,我们使用MMDF过滤不同生物样品中的潜在代谢物[30]。将原型的公式输入PeakView SoftwareTM,然后分别设置不同的MDF模板,包括原型、葡萄糖醛酸化、硫酸化等[31]。接下来,通过可能的代谢途径和质量缺陷耐受性过滤代谢物。I相和II相代谢物的缺陷通常设置为±50 mDa,每个模板窗口的缺陷窗口设置为100 mDa。此外,还利用DFIF、PIF和FNLF功能对体内代谢物进行鉴定和确认。不同类型代表化合物的质谱信息包括准确质量、保留时间、特征片段和诊断离子在内的可用于过滤代谢物。例如,273/271(C15H12O5)和153/151(C7H4O4)是类黄酮代谢物碎片产生的两个重要碎片离子,包括正离子和负离子模式下的羟基化产物、葡萄糖醛酸结合物和硫酸盐结合物。最后,如表S2所示,大鼠灌胃达立通颗粒后发现60种原型化合物和87种代谢物,包括80种黄酮类化合物、29种萜类化合物、21种生物碱、10种有机酸和7种香豆素。此外,结果表明,大鼠胃、血浆、肝脏、肾脏、空肠、结肠、尿液和粪便中的原型化合物和代谢物的数量存在差异。一方面这可能是由于大鼠生物样本中发现的化合物浓度和MS片段的丰度不同所致。另一方面,达立通颗粒中不同类型化合物的首选代谢器官和代谢途径可能不同。例如,I相主要发生在肝脏[32]。达立通颗粒中六种典型代谢物的提取离子色谱、MS/MS谱和裂解模式(柚皮苷的硫酸化和葡萄糖醛酸代谢产物、芹菜素的甲基化代谢产物、巴马汀的去甲基化、羟基化和葡醛酸代谢物、巴马汀的去甲基代谢产物、氨甲酰糖苷的去糖基化代谢产物以及柴胡皂苷D的去糖基化和去甲基化为羧酸代谢产物)如图5所示。
3.2.1.体内原型成分的鉴定
在大鼠的生物样品中发现了60种原型成分,包括33种黄酮类化合物、11种生物碱、7种萜类化合物、6种香豆素和3种有机酸。血浆中发现了21种原型成分,包括原儿茶酸(P5)、氰菊酯(P35)、黄连素(P45)、李宁(P48)、四氢巴马汀(P52)、橙皮苷(P53)、地奥司明(P54)、芍药苷(P63)、木犀草素(P70)、樱皮素(P73)、异樱皮苷(P76)、环氧乌拉pten(P78)、芹菜素(P80)、3',7-二甲基槲皮素(P81)、鼠李素(P84)、环氧麦角菌素(P86)、5-6-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮(P91)、桂皮素(P94)、5-6-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮(P101)、木香内酯(P104)、和脱氢壳内酯(P105),这表明黄酮类化合物是主要的口服达立通颗粒后吸收有效成分。此外,在胃中发现51种代谢物,在肝脏中发现8种,在肾脏中发现15种,在空肠中发现16种,在回肠中发现11种,在尿液中发现39种,在粪便中发现16个。图S1显示了空白组大鼠血浆样品和服用达立通颗粒的血浆样品通过UPLC-Q-TOF-MS显示的正离子模式和负离子模式下的基峰色谱图(BPC)。从图S2到图S8可以看到其他生物样品的正离子模式和负离子模式基峰色谱图(BPC),包括组织样本、尿液样本和粪便样本。
3.2.2.体内类黄酮相关成分的鉴定
类黄酮是达立通颗粒的主要成分,在大鼠的生物样品中鉴定出80种类黄酮相关原型和代谢物。如图6所示,发现黄酮类化合物的主要代谢途径为甲基化、乙酰化、磺化和葡萄糖醛酸化[33]。例如,根据m/z 271.0617[M-H]-,151.0033[M-H-C8H8O]-处的诊断离子和m/z 119.0505[M-H-C-C7H4O4]-处的碎片离子,P77(C15H12O5,tR=12.524 min)被推断为柚皮素。结果表明,通过设置硫酸化和葡萄糖醛酸化两种MDF模板,M23(C21H20O14S,tR=8.307 min)的光谱在M/z 527.0501处具有准分子离子[M-H]-。m/z 447.090,2351.0093处的碎片离子和MS2光谱中的诊断离子271.0580表明SO3和Glu损失。因此,M23被推断为葡萄糖醛酸化和硫酸化P77的代谢物。
P79(C15H10O5,tR=12.563 min)根据其在m/z 271.0601[M+H]+(诊断离子)和243.0648[M+H-CO]+(正离子模式)以及269.0456[M-H]-(负离子模式)的片段离子推断为芹菜素。m/z 153.0190[M+H-C8H6O]+下的产物离子(诊断离子)和119.0521[M+H-C7H4O4]+通过RDA反应得到,表明A环上有羟基双取代基,B环上有羟单取代基[20,24]。MDF发现M51的准分子离子(C16H12O5,tR=11.062 min)(图5B)比P79高14 Da,M40的片段离子167.0309比P79的诊断离子153.0190高14 Da,表明甲基化结合位点位于A环上[15]。因此,M51可能是P79的甲基化代谢产物,代谢物M31(C21H18O11,tR=9.004 min)在m/z 445.0766[m-H]处显示出准分子离子,比P79高176 Da,其在m/z 269.0447和254.0229处的MS2产物离子对应于负离子模式下的P79。因此,M31是P79的葡萄糖醛酸化代谢产物。如表S2所示,总结了生物样品中类黄酮相关原型和代谢物的详细信息。
3.2.3.体内生物碱相关成分的鉴定
共鉴定出23种生物碱相关原型和代谢物,主要存在于胃和尿液中。如图7所示,发现生物碱的主要代谢途径是氢化、羟基化、葡萄糖醛酸化、去氢、去甲氧基化和环裂解。例如,C64(C21H22NO4+,tR=10.608 min)通过其在m/z 352.1543[M]+、336.1230[M-CH4]+、322.1072[M-2CH3]+(诊断离子)、308.1284[M-CH4-CO]+和119.0505[M-H-C7H4O4]-处的产物离子推断为巴马汀。同样,使用不同的MDF窗口和PIF、FNLF和DFIF策略过滤生物碱相关代谢物。MDF计算表明,代谢产物M35(C20H20NO4+,tR=9.442 min)(图5D)比C64低14 Da,M54(C21H20NO4],tR=11.420 min)比C64低2 Da。M35在m/z 338.1392[M]+处显示出准分子离子。在m/z 322.1073和294.1133处发现的碎片离子源于母体离子的16 Da(-CH4)和28 Da(-CO)的连续损失。因此,M35被推断为巴马汀的脱甲基产物。M54的主要碎片离子位于m/z 350.1367[M]+、306.1324[M-CH4-CO]+,表明M54可能是巴马汀的脱氢产物。此外,代谢物M27(C25H28NO11+,tR=8.472 min)(图5C)比巴马汀高166Da。M27在m/z 518.1662[M]+处显示出准分子离子。在m/z 342.1335和324.1147处发现产物离子,其来源于母体离子连续损失176 Da(-Glu)和18 Da(-H2O)。m/z处发现的碎片离子176.0714[M-Glu-C10H14O2]+(诊断离子),提示M27可能是C64的双脱甲基、羟化酶和葡萄糖醛酸化产物[34]。
3.2.4.体内萜类相关成分的鉴定
共鉴定出30种萜类相关原型和代谢物,主要存在于胃、尿液和粪便中。萜类主要包括倍半萜内酯、环烯醚萜和三萜皂苷。如图8所示,在本研究的数据分析中发现萜类化合物的主要代谢途径是氢化、脱糖基化和脱氢。以代谢物M72(C36H56O10,tR=19.012 min)(图5F)为例,显示了鉴定过程。M72的光谱在M/z 647.3784处显示出[M-H]-准分子离子。在m/z 471.3491处发现诊断离子,根据母体离子显示损失176 Da(-Fuc-2O+2H)。MMDF计算表明,柴胡皂苷D在M/z 779.4562处显示出[M-H]-准分子离子,比在M72的MS2光谱中发现的M/z 647.3784高132Da。在m/z 617.4080和m/z 471.3491处发现诊断离子,其来源于母体离子的162 Da(-Glc)和146 Da的连续损失。因此,M72被确定为柴胡皂苷D的脱糖基和脱甲基反应生成羧酸(-2H+2O)产物。
4.结论
利用UPLC-Q-TOF-MS/MS和NCFS技术,我们在达立通颗粒中鉴定出108种化学成分;在大鼠口服达立通颗粒后的生物样本中共推测出147种化学成分(60种原型化合物和87种代谢物)。我们的数据将有助于深入研究达立通颗粒可能的药理物质基础。
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