依据《中药复方制剂整体质量评价体系的构建及应用》中关于构建中药复方制剂整体质量评价体系的技术路线，按照《达立通颗粒整体质量研究方案》，开展达立通颗粒整体质量评价研究，包括研发立项研究、组方和方解研究、中药材/饮片质量研究、生产过程控制技术研究、作用机制研究、质量标志物和生物标志物研究、循证医学研究、药物经济学研究。根据项目进展情况，我们将陆续报道相关研究成果。本期介绍达立通颗粒挥发油GC指纹图谱研究及GC-MS成分分析研究成果。

摘要：目的  建立达立通颗粒挥发油GC指纹图谱，并采用GC-MS法进行成分分析。方法  以AgilentHP-5（30m×0.32mm，0.25μm）石英毛细管柱进行分离，进样量1μL，高纯度氮为载气，流速1.0mL/min，氢火焰离子检测器（FID）检测，程序升温，前进样口温度250℃，检测器温度280℃，分流比为20：1。建立10批样品图谱共有模式，结合化学计量学法分析。通过NIST11.L标准谱库检索GC-MS分析成分，并对达立通颗粒挥发油成分进行归属。结果  从10批样品共有图谱中选取13个共有峰，各成分相似度均大于0.998，样品可分为3类。通过GC-MS共鉴定出56种成分，包含11个共有峰，并对各共有峰进行归属。结论  建立的达立通颗粒挥发油GC指纹图谱，精密度、重复性与稳定性良好，可为达立通颗粒挥发油质量控制提供参考依据。

关键词：达立通颗粒；挥发油；指纹图谱；GC-MS

 

中药挥发油分布广泛，药理作用显著，为中药研究中不可或缺的一部分。由于挥发油易挥发、成分复杂、含量差异大，挥发油质量受多种因素影响，致使难以控制中药挥发油及含挥发油制剂质量。达立通颗粒收载于《中国药典》（2020年版）一部中，该药清热解郁、和胃降逆、通利消滞，常用于治疗功能性消化不良、功能性胃十二指肠病、反流性胃病等。该药由十二味中药组成，其中柴胡、枳实、木香、陈皮中挥发油为主要活性成分，经现代药理研究可知：柴胡挥发油可解热、镇痛；枳实、木香挥发油均存在抑菌、抗溃疡活性；陈皮挥发油则能有效增强胃肠道消化能力。各挥发油对达立通颗粒疗效具有一定作用。

达立通颗粒制备工艺提取了以上四味药材挥发油，但质量标准中未对挥发油进行定性定量分析，即建立该药物挥发油指纹图谱对其质量控制有重要意义。本实验以GC法建立达立通颗粒挥发油指纹图谱，评价10批达立通颗粒油图谱相似度，结合化学计量学法，并采用GC-MS对挥发油成分进行鉴定分析，为各共有峰进行药材归属，可为达立通颗粒挥发油质量控制提供方法及制剂整体质量控制提供更全面参考。

1、仪器与试剂

1.1 仪器

安捷伦7890B气相色谱仪、安捷伦7890A-5975C气相质谱仪、AgilentHP-5毛细管柱（30m×0.32mm，0.25μm）（美国安捷伦公司）、SXKW数显恒温电热套（北京永光明医疗仪器有限公司）、0.5μL-10μL移液枪（上海BIO-DL公司）、BS214D型万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、MS105DL型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）等。

1.2 试剂

达立通颗粒（每袋6g  批号：211139、211140、211128、211243、211246、211249、211250、211251、211252、211253编号：S1～S10）、正己烷（色谱纯），购自上海麦克林生物科技有限公司。原药材：北柴胡（批号：2210219芍花堂国药股份有限公司）、木香（批号：210101丽江华利生物开发药业有限公司）、枳实（批号：Q201035产地：江西新干）、陈皮（批号：210107亳州金芍堂中药饮片有限公司），以上均由南昌弘益药业有限公司提供，经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为正品。对照品：γ-萜品烯（B21981含量≥95%）、芳樟醇（B20387含量≥98%）、β-榄香烯（B23134含量≥98%）、购自上海源叶生物科技有限公司；对伞花烃（COAA-17-D0004491  含量=99.2%）购自上海道垚测试技术有限公司；D-柠檬烯（CDCT-C14634100含量=98.66%），购自美国LGC公司。

1.3 测试溶液制备

1.3.1 供试品溶液

称取适量达立通颗粒研细，精密称取细粉100g，置2000mL烧瓶中，加入8倍量超纯水，按《中国药典》（2020年版）四部挥发油测定法（甲法），提取7h，收集的挥发油，采用无水硫酸钠脱水，放置12h，脱水后挥发油密封转移至4℃下避光保存。

精密量取挥发油10μL，置2mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备10批供试品溶液S1～S10。

1.3.2 对照品溶液

分别精密量取各对照品对伞花烃0.75mg、D-柠檬烯1.64mg、γ-萜品烯1.05mg、芳樟醇0.70mg、β-榄香烯0.20mg，置于2mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

1.3.3 各药材挥发油溶液

取木香、枳实、陈皮、北柴胡药材，用高速粉碎机粉碎，过2号筛后分别称取160g，置3000mL烧瓶中，按“1.3.1供试品溶液”提取方法提取挥发油，因北柴胡药材挥发油提取量较少，难以收集，在其挥发油提取器中加入2mL正己烷，相同处理方法脱水保存，配制各药材挥发油溶液。北柴胡挥发油溶液配制则取脱水后正己烷层，置5mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

2、方法与结果

2.1 气相色谱条件色谱柱：AgilentHP-5毛细管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；载气：氮气；流速：1.0mL/min；进样量：1μL；前进样口温度：250℃；检测器：FID；程序升温：起始温度40℃；以10℃/min的速率升至90℃，保持2min；以2℃/min的速率升至140℃，保持5min；再以5℃/min速率升至180℃，保持2min；最后以10℃/min升至250℃。检测器温度：280℃；分流比：20：1。

2.2 质谱条件色谱柱：AgilentHP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；载气：氦气；采用EI离子源，电子能量：70ev；参数采集模式：全扫描；溶剂延迟：4min；流速：1.0mL/min；进样量：1μL；程序升温条件与“2.1气相色谱条件”一致，离子源温度230℃，四极杆温度150℃；扫描范围：30～650amu。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度  取（编号：S1）达立通颗粒配制供试品溶液，按“2.1项下气相色谱条件”，连续进样6次，以7（S）号γ-萜品烯峰为参照峰，分别计算各次共有峰相对保留时间与相对峰面积。计算结果可知，各共有峰相对保留时间≤0.05%，相对峰面积≤1.18%。表示此仪器精密度良好。

2.3.2 重复性  取同一批次（编号：S1）达立通颗粒，平行配制6份供试品溶液。按“2.1项下气相色谱条件”，以7（S）号γ-萜品烯峰为参照峰，将6份供试品进样，分别计算各份供试品溶液共有峰相对保留时间与相对峰面积。计算结果可知，各共有峰相对保留时间≤0.17%，相对峰面积≤0.40%。表示此方法重复性良好。

2.3.3 稳定性  取（编号：S1）达立通颗粒配制供试品溶液，按“2.1项下气相色谱条件”分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，以7（S）号γ-萜品烯峰为参照峰，分别计算各次共有峰的相对保留时间和相对峰面积。计算结果可知，各共有峰相对保留时间≤0.22%，相对峰面积≤0.94%。表示此供试品溶液在24h内稳定。

2.4 达立通颗粒挥发油GC指纹图谱建立

将S1～S10达立通颗粒挥发油气相色谱图数据以AIA格式按相应顺序导入至“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”中，处理可得批达立通挥发油GC图谱叠加。设置参照图谱S1，时间窗宽度0.1min，选择中位数法，进行多点校正，设置Mark峰匹配，匹配结果确定了13个共有峰，生成对照图谱，可得10批达立通颗粒批挥发油GC图谱及对照指纹图谱叠加图，单独显示对照图谱，得挥发油GC对照指纹图谱。通过达立通颗粒挥发油图谱与混合对照品图谱对比，鉴定出了5种成分，4号峰为对伞花烃，5号峰为D-柠檬烯，7号峰为γ-萜品烯，10号峰为芳樟醇，11号峰为β-榄香烯。其中7号峰位较高，且峰形良好，可作为参照峰（S）。

2.5 相似度评价

对照指纹图谱建立后，以其为参照，选择进行相似度评价。由实验结果可知，S1～S10各批次达立通颗粒挥发油指纹图谱与对照指纹图谱相似度在0.998～0.999之间，符合相似度计算要求。各共有峰分离度均大于1.5，分离度良好。

2.6 共有峰归属

将正己烷溶剂、“1.3.3项下各原药材溶液”分别按照“2.1项下气相色谱条件”进样，记录各自图谱。空白溶液与对照品图谱、供试品溶液图谱相比，未在对照品位置、各成分峰位置出现干扰峰，可知空白试剂无干扰。

将北柴胡、陈皮、木香、枳实挥发油与供试品溶液图谱相对保留时间对比共有峰归属：1～7，9～13号峰，来自北柴胡；1～7，9、10、11号峰，来自陈皮；1～13号峰来自枳实；1～7，9～13号峰，来自木香。

2.7 聚类分析

利用选定的13个共有峰峰面积，对10批达立通颗粒进行聚类分析（HCA）。将数据输入至BMSPSSStatistics21中，数据标准化处理，以ward法，平方Euclidean距离进行计算，建立聚类分析树状图。可得，10批达立通颗粒共分为3类，S1、S10、S5、S4为一类，S6、S8、S3为一类，S2、S7、S9为一类。

2.8 主成分分析

运用SIMCA14.1软件，以选定的13个共有峰峰面积为变量，为10批达立通颗粒挥发油进行主成分分析（PCA）。该模型建立提取得到3个主成分，其特征值均＞1。模型参数中R²X=0.936、Q²=0.616，表明3个主成分可显示样品中93.6%的信息，符合模型预测标准，该模型稳定可靠。10批达立通颗粒可分为3类，与聚类分析结果一致。

2.9 正交偏最小二乘法-判别分析

HCA与PCA均将样品分为3类，则进一步探究对组间差异影响能力大的成分。在PCA数据基础上建立正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）模型，进行统计及变量重要性投影（VIP）分析。该模型R²X=0.856、R²Y=0.862、Q²=0.768，置换检验中R²=（0.0，0.165）、Q²=（0.0，-0.662），表示符合模型预测标准，未过度拟合，该模型稳定可靠。VIP值越高，则相应成分对组间质量差异影响越大。

3、挥发油GC-MS成分分析

根据以上质谱条件，将制备供试品溶液与各单味药材挥发油溶液直接进样，进样结果经NIST11.L标准谱库检索，选取匹配度≥90的匹配数据，若同一物质存在多个匹配度较高成分选项，则选取最高匹配度成分，结合查阅相关文献资料确定化合物名称。对分离出的成分进行分析，运用面积归一化法检测各成分相对含量。经GC-MS总离子流图与共有模式指纹图谱对比，可对共有峰推测：1号峰为（+）-α-蒎烯，2号峰为（-）-β-蒎烯，3号峰为β-月桂烯，4号峰为对伞花烃，5号峰为D-柠檬烯，6号峰为β-罗勒烯，7号峰为γ-萜品烯，9号峰为萜品油烯，10号为芳樟醇，11号峰为β-榄香烯，12号峰为β-石竹烯

4、讨论

4.1 提取条件及色谱条件考察

本实验采用《中国药典》中挥发油提取法提取供试品挥发油，考察提取时间（5h、7h、9h）、料液比（6：1、8：1、10：1），经实验筛选：取100g达立通颗粒时，加8倍水，提取7h为最佳提取条件。为得到色谱峰较多且分离度更好得指纹图谱，通过改变气相色谱条件进行比较，分流比（10：1、20：1、30：1）、进样口温度（250℃、260℃、270℃）、程序升温条件、溶剂选择（无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷），最终选定出色谱峰最多，分离度最好的条件。

4.2 相似度分析

基于中药挥发油特点，本实验建立了达立通颗粒挥发油GC指纹图谱，在其生产的10批达立通颗粒中，相似度均≥0.998，说明各批次达立通颗粒挥发油质量较稳定，化学成分整体性特征差异小。挥发油虽性质不稳定，易受热影响等，只要严格把控原药材生产加工、挥发油提取、制剂工艺等环节，确保各原药材品种来源一致，工艺中间产物及动态过程可控，制剂质量可溯源，产品质量可做到均一稳定。HCA、PCA结果均将10批达立通颗粒分为3类，OPLS-DA法中根据VIP值得出：5号峰（-）-β-蒎烯、7号峰D-柠檬烯、13号峰可能为导致达立通颗粒挥发油质量差异成分。

4.3 GC-MS成分分析结果

经过NIST11.L标准谱库匹配结合查找文献，从挥发油中分析出56种成分，占图谱中总峰面积的91.79%。其中相对百分含量较高的5种成分（D-柠檬烯、芳樟醇、γ-萜品烯、对伞花烃、β-罗勒烯）在木香、枳实、陈皮、北柴胡各药材挥发油溶液GC-MS分析中均有出现，为其所共有成分，在各原药材中含量也相对较高。对达立通颗粒挥发油指纹图谱中13个共有峰成分进行了初步确认，推测出11个共有峰成分，共有挥发性成分以单萜类、倍半萜类物质居多，其中D-柠檬烯（35.79%）相对百分含量最高为达立通颗粒挥发油主要成分。有文献报道，D-柠檬烯具有菌、免疫调节多种作用；可通过诱导细胞凋亡及抑制细胞周期产生抗癌活性，并在治疗胃肠道疾病中发挥抗炎镇痛及胃保护功效。本实验所建立的达立通颗粒挥发油GC指纹图谱，方法简便，结果可靠，结合化学计量学法互为补充，为挥发油在达立通颗粒中质量控制提供理论依据。并对化学成分进行分析与归属，推测出56种成分，为进一步探究达立通颗粒挥发油药效成分及来源提供参考。

 

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