依据《中药复方制剂整体质量评价体系的构建及应用》中关于构建中药复方制剂整体质量评价体系的技术路线，按照《达立通颗粒整体质量研究方案》，开展达立通颗粒整体质量评价研究，包括研发立项研究、组方和方解研究、中药材/饮片质量研究、生产过程控制技术研究、作用机制研究、质量标志物和生物标志物研究、循证医学研究、药物经济学研究。根据项目进展情况，我们将陆续报道相关研究成果。本期介绍达立通颗粒中延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的测定及在大鼠体内药代动力学研究成果。

一、摘要

1、目的

研究达立通给药后大鼠体内主要药物成分及药代动力学特点。

2、方法

建立同时检测延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，应用于测定大鼠血浆和组织中药物浓度及药代动力学特征。

3、结果

建立了同时定量测定延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯方法，单次ig给予达立通浸膏后，延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯可以快速吸收进入体内，在血中峰浓度（Cmax）分别为（13.73±7.50）、（27.01±17.69）、（66.73±29.94）ng/mL，曲线下面积（AUC0-t）分别为（80.43±40.03）、（41.30±28.69）、（303.90±136.69）ng·h/mL，消除半衰期（T1/2）分别为（5.82±2.22）、（1.08±0.01）、（4.95±2.53）h。多次给药能明显增加各物质体内暴露水平。三种成分在大鼠的主要组织/器官中广泛分布，在胃肠道中暴露水平最高，其次是肝和肾。三种成分存在明显的雌雄差异，在雌性大鼠中的暴露量（C_max和AUC）均显著高于雄性大鼠（p<0.05）。

4、结论

UPLC-MS/MS测定延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的方法准确、灵敏、可靠。达立通颗粒中胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯可吸收进入血液、广泛分布于体内组织、器官、较快代谢/消除，为达立通颗粒潜在的体内药代标记物。

二、引言

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是临床中最常见的一种功能性胃肠道疾病。FD全球总发病率约为16%，但因不同国家或者对于其定义标准不同，该指数稍有变动。根据罗马Ⅳ标准，功能性消化不良是发生在胃和十二指肠的一系列症状，包括上腹痛、饱胀、早饱、嗳气、食欲不振、恶心、呕吐等不适症状，经检查排除引起上述症状的器质性疾病的一组临床综合征，可单独或以一组症状出现。其主要分为三种亚型，餐后窘迫综合征（Postprandial distress syndrome，PDS）、上腹痛综合征（Epigastric pain syndrome，EPS）和重叠型（PDS-EPS重叠综合征）。PDS主要表现为餐后饱胀或早饱，主要由胃肠道运动不足引起，而EPS表现为上腹痛或灼烧感，主要由内脏高敏感引起。

由于FD的发病机制复杂，目前尚无标准治疗方法。目前治疗FD的常规药物包括质子泵抑制剂（PPIs）、促动力药和三环类抗抑郁药（TCAs）。这些药物仅针对主要症状治疗，因此大多数疗效不佳。并且，尚未有一种治疗方法和药物能够长期改善FD患者的症状。中药由于具有多组分和多靶点的特征，在FD的治疗中逐渐受到青睐，有研究表明，有高达50%的FD患者尝试针灸和中药等替代疗法。

达立通颗粒是由柴胡、枳实、木香、陈皮、清半夏、蒲公英、焦山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索、六神曲（炒）十二味中药组成，主要用于运动障碍型功能性消化不良，在临床上对功能性消化不良有良好的疗效。实验室前期研究表明，SD大鼠ig给药达立通颗粒提取物，体内可检测出147种化合物，其中22种化合物可以入血，包括生物碱类延胡索乙素、黄酮类川陈皮素和萜类木香烃内酯等。研究表明，这些化合物具有较好的镇痛、缓解炎症和改善胃肠道功能障碍等药理作用。因此，我们认为这些化合物可能是达立通颗粒能有效治疗功能性消化不良的潜在药效物质。十分有必要开发这些化合物的定量检测方法。

本研究建立并全面考证了SD大鼠ig给药达立通浸膏后血浆中延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的UPLC-MS/MS共检测方法，并应用于不同性别SD大鼠的药代动力学和组织分布研究。为达立通颗粒治疗功能性消化不良提供了临床指导。

三、材料

1、仪器

AB Sciex 5500+三重四级杆质谱仪；ExionLC二元泵（AB SCIEX，美国）；ExionLC 自动进样器（AB SCIEX，美国）；ExionLC柱温箱（AB SCIEX，美国）；Milli-Q Gradient A10超纯水机（Millipore，德国）；Sovall Biofuge Stratos 低温高速离心机（Thermofisher Scientific，美国）。

2、试剂

乙腈（色谱级）购自美国TEDIA公司，甲醇（色谱级）购自德国Merck公司，甲酸（LC-MS级）购自美国Thermo Fisher公司。内标氯苯丙氨酸购自美国Sigma公司，对照品延胡索乙素（Tetrahydropalmatine）（批号：Y21S7Y17091）、川陈皮素（Nobiletin）（批号：G13D11L134229）和木香烃内酯（Costunolide）（J22GB152180）均购自上海源叶生物科技有限公司。以上对照品质量分数均大于98.0%。达立通颗粒浸膏（DLT）（1g浸膏含3.6g生药，经LC-MS/MS测定，含延胡索乙素51.05μg/g，川陈皮素148.05μg/g，木香烃内酯14.35μg/g）（批号：J210522）由南昌弘益药业有限公司提供。实验过程中所用其余试剂均采用市售分析纯，实验用水由实验室的超纯水机（MiLLi-Q Gradient A10）制备。

3、实验动物

SPF级SD大鼠（雌性各半，220g～250g），购于浙江维通利华有限公司。实验动物生产许可证号为SCXK（浙）2019-0001。所有动物均饲养于中国药科大学动物实验中心，期间给予标准饲料及饮用水，室温保持在（23±2）℃，相对湿度为（50±15）％，12h昼夜交替。所有动物均在新的环境中适应7天。

四、方法

1、试验条件

色谱条件：色谱柱：Waters XSelect® HSS T3 柱（3.5μm 4.6×100mm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～1min，3%B；1～2.5min，3～90% B；2.5～6min，90%；6～7min，90～3%B；7～8min，3%B），每针进样前均平衡3min。流速：0.7ml/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

质谱条件：点电喷雾离子（ESI）源，正离子检测模式；多反应监测（MRM）数据采集模式；辅助气体1（Ion Source Gas 1，GS1，N2），55Arb；辅助气体2（Ion Source Gas 2，GS2，N2），60Arb；辅助气温度（Temperature，TEM），550℃；气帘气（Curtain Gas，CUR，N2），40Arb；碰撞气（Collision Gas，CAD，N2），10Arb；入口电压（Entrance Potential/EP）：10V；出口电压（Collision Cell Exit Potential，CXP）：15V。分别对待测物进行离子对优化。

2、主要溶液的配制

（1）延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯及氯苯丙氨酸（IS）储备液的制备

精密称取延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯对照品各10mg，分别转至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，充分颠倒将其混匀，配制成终浓度为1.0mg/mL的储备液，保存在-20°C备用。

（2）氯苯丙氨酸（IS）储备液的制备

精密称取氯苯丙氨酸对照品0.01045g，转移至容量瓶（10mL）中，用甲醇定容至刻度线，上下颠倒将其充分摇匀，配制成终浓度为1.0mg/mL的内标储备液，4℃存备用。

（3）蛋白沉淀剂的制备

取内标（IS）储备液（1.0mg/mL）50μL，加入950μL甲醇稀释至浓度为50μg/mL，之后取1mL内标溶液（50μg/mL）置于1000mL带盖玻璃试剂瓶中，加入1000mL甲醇至试剂瓶刻度线位置，充分混匀，得到含内标（50ng/mL）的甲醇溶液，将该甲醇溶液用作生物样品处理过程中的蛋白沉淀剂，4℃储存备用。

（4）标曲工作液及质量控制（QC）工作液的制备

取延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯储备液，用甲醇稀释为一系列浓度的混标工作液。混标中含延胡索乙素浓度为：25、50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL；含川陈皮素和木香烃内酯浓度为：50、100、200、500、2000、5000、10000ng/mL。此外，从重新制备的新的储备液中分别稀释成高浓度质控HQC工作液（含延胡索乙素：4000ng/mL，川陈皮素和木香烃内酯：8000ng/mL），中浓度质控MQC工作液（含延胡索乙素：1000ng/mL，川陈皮素和木香烃内酯：2000ng/mL）和低浓度质控LQC工作液（含延胡索乙素：500ng/mL，川陈皮素和木香烃内酯：1000ng/mL）。

（5）给药溶液的制备

取达立通颗粒浸膏，精密称定质量，加入一定量的超纯水，分别配制成0.32g/mL和0.64g/mL的达立通颗粒浸膏水溶液（DLT）。现配现用。

3、生物样品的处理

取大鼠血浆或组织匀浆液（称取0.1g组织，剪碎后，加入500μL生理盐水高速组织匀浆器处理为0.2g/mL的组织匀浆液）50μL，以1：4的比例加入蛋白沉淀剂200μL，振荡（1800r/min，5min），两次离心（18000r/min，5min，4℃）后，转移上清液60μL至进样瓶中进样分析。

4、方法学考证

该方法的特异性、线性、精密度和准确度、提取回收率、基质效应、稳定性和残留效应均按照美国FDA生物分析方法验证指南进行验证。

（1）专属性

取六只不同来源的SD大鼠的空白血浆、含对照品（MQC）空白血浆以及ig.DLT后血浆样品分别按“生物样品的处理”项处理，LC-MS/MS进样分析得到典型色谱图。

（2）标准曲线和定量下限

取空白SD大鼠血浆样品若干份，每份45μL，分别加入5μL含有延胡索乙素、川陈皮素与木香烃内酯的系列混合工作液，充分混匀后配置成含有川陈皮素终浓度为2.5、5、10、20、50、100、200、500ng/mL，含有川陈皮素和木香烃内酯终浓度均为5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的标准生物样品。按照“2.3”项下方法进行样品前处理后LC-MS/MS进样分析，以测得生物样品中延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的理论终浓度为自变量（x），延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的峰面积与内标的峰面积的比值为因变量（y），进行回归运算（权重系数，W：1/x或1/x2），得到所检测物质在生物样品中的线性回归方程。线性范围中最低浓度点为定量下限（S/N>10）。

（3）精密度与准确度

通过分析质控样品在同一天内和连续三天分别分析三批质控样品来评估精密度和准确度。每批平行制备5个样品，根据每个批次的标准曲线计算其浓度。日内和日间精密度（RSD）不应超过15%，准确度（RE）应在±15%以内。

（4）提取回收率和基质效应

提取回收率是衡量样品制备的提取效率，通过提取样品的峰面积和提取后再加标样品的峰面积比来衡量提取回收率。

基质效应是通过提取后加标样品与加有相同浓度待测物的水溶液的峰面积比来衡量。各组处理方式均平行制备3个浓度水平的5份样品。

（5）稳定性

在以下储存条件下，通过分析3个浓度水平的质控样品，每个浓度样品平行制备5份，对各待测物稳定性进行了评估：室温下放置6小时；处理后的样品在4℃进样盘中放置12小时，处理后样品在-20℃下储存24小时；经过三次冻融循环（-70℃到室温），在-70℃下储存7天。当准确度偏差在标准浓度的±15%以内时，则认为该待测物在基质中稳定。

（6）残留效应

残留效应是通过在定量上限（ULOQ）样品后进样空白样品，空白样品中的待测物峰面积应小于定量下限（LLOQ）的峰面积的20%。

5、药物代谢动力学和组织分布研究

（1）药物代谢动力学研究

单剂量给药组：取12只SD大鼠（雌雄各半），禁食不禁水12小时后，ig达立通颗粒浸膏水溶液，给药剂量为6.4g/kg。在给药前（0 h）和给药后0.083、0.25、0.75、1、2、4、6、8和12h，从每只大鼠的眼眶静脉采集血样（约200μL），然后立即以8000r/min离心5分钟，将上清血浆转移到干净的试管中。

多剂量给药组：为连续七天ig达立通颗粒浸膏水溶液，给药剂量为3.2g/kg，采集末次给药前（0 h）和给药后0.083、0.25、0.75、1、2、4、6、8和12h的全血，离心分离血浆。根据“生物样品的处理”项样品处理方法尽快处理样品，进样分析。

（2）组织分布研究

取SD大鼠24只，随机分成四组（4个时间点，每个时间点6只，雌雄各半），将四组受试大鼠禁食12h后，ig达立通颗粒浸膏水溶液（3.2g/kg），分别于给药后15min、45min、4h、12h由股动脉放血处死受试大鼠，接取200μL大鼠静脉血（采血管预先加入5%肝素抗凝），并立即取脑、肌肉、脂肪、性腺、脾脏、肾脏、胃、肠（十二指肠、结肠）、肝脏、肺脏、心脏和胸腺组织。其中脑组织用吸水纸擦去表层毛细血管，心脏、肾脏等组织需剖开冲净淤血，胃、肠等组织需剖开洗净内容物，肝脏组织直接剪取肝大叶。按“生物样品的处理”项样品处理方法尽快处理样品，进样分析。

6、数据分析

采用WinNonlin 6.4软件（Phoenix 64，Build 6.4.0.768）中的非房室模型（Noncompartment analysis，NCA）分别拟合3种待测物在SD大鼠体内的药代动力学参数：Cmax（灌胃给药后血浆药物浓度峰值）；Tmax（灌胃给药后达峰时间；AUC0–t（0 h到12 h的血药浓度-时间曲线下面积）；AUC0-∞（0 h到无限大时间的血药浓度-时间曲线下面积）；T1/2（消除相半衰期）。结果用Mean±SD表示。应用GraphPad Prism 8中的T检验进行组间差异分析，P＜0.05认为具有显著性差异。

五、结果

1、专属性

根据保留时间和MRM来确定待测物的色谱峰。三种待测物和IS在保留时间处没有内源性物质干扰。

2、标准曲线和定量下限

延胡索乙素在2.5ng/mL～500ng/mL的线性范围内线性良好，川陈皮素和木香烃内酯线性范围为5.0ng/mL～1000ng/mL。延胡索乙素定量下限为2.5ng/mL，川陈皮素和木香烃内酯的定量下限为5.0ng/mL。

3、精密度、准确度、提取回收率和基质效应

各待测物的精密度、准确度均在可接受范围内。延胡索乙素的提取回收率和基质效应在可接受范围内，而川陈皮素基质效应为“130.61%～142.94%”，说明可能存在基质增强作用。而木香烃内酯的提取回收率为“65.83～77.87%”间，在可接受范围。

4、稳定性

不同实验条件下的稳定性数据汇总分析结果表明，延胡索乙素在不同条件下均稳定。而川陈皮素在-70℃下储存7天后，其浓度下降了41.05%，在其他条件下稳定。在室温下放置6小时后，木香烃内酯的浓度下降了95.71%，而在-70℃下储存7天后，浓度下降了28%。但按上述“生物样品的处理”方法处理后，无论在4℃还是-20℃保存，其浓度都保持稳定。

5、残留效应

空白样品中各待测物的峰面积均低于定量下限的20%，证实该分析方法无明显残留。

6、药物代谢动力学和组织分布研究

单次ig达立通颗粒浸膏水溶液（6.4g/kg）后45min的血浆样品中的延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的Tmax分别为（1.40±0.93）、（0.63±0.28）、（2.38±8.81）h，Cmax分别为（13.73±7.50）、（27.01±17.69）、（66.73±29.94）ng/mL，AUC0-t分别为（80.43±40.03）、（41.30±28.69）、（303.90±136.69），T1/2分别为（5.82±2.22）、（1.08±0.01）、4.95±2.53）h。

多次ig达立通颗粒浸膏水溶液（3.2g/kg）后，延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯的Tmax分别（1.08±0.59）、（0.67±0.19）、（2.30±2.75）h，Cmax分别为（19.77±10.81）、（24.58±12.17）、（41.93±30.10）ng/mL；T1/2分别为（5.48±1.09）、（0.46±0.00）、（5.64±2.02）h，AUC0-t为（106.00±64.90）、（24.58±12.17）、（210.57±117.89）ng·h/mL。尽管多次给药的给药剂量（3.2g/kg）为单次给药（6.4g/kg）的一半，但多次给药后，各待测物的Tmax、T1/2相近，Cmax、AUC与单次给药无明显差异，说明多次给药后，能够明显增加各物质在大鼠体内的暴露量，但不影响其吸收和代谢速度。

无论是在单次ig给药还是多次ig给药后，雌雄大鼠各待测物的药代动力学参数都存在明显差异。雌性大鼠的C_max和AUC_0-t、AUC_0-∞均显著高于雄性大鼠（p<0.05），表明雌性大鼠中各待测物的暴露量明显高于雄性大鼠。此外，单次ig给药后延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯三种待测物的T1/2都小于8小时，表明各待测物在大鼠体内快速消除，未见明显蓄积。单剂量ig达立通颗粒浸膏水溶液后，延胡索乙素的T_max在雌性大鼠中小于雄性大鼠，说明延胡索乙素在雌性大鼠中比在雄性大鼠中吸收得更快。T_1/2相近，说明消除速率不存在差异。川陈皮素的暴露量很低，只在雌性大鼠中检测到。雌性大鼠血药浓度达到峰值的时间相对较快。另外值得注意的是，木香烃内酯分别在0.25h～0.75h和6h～8h左右观察到双吸收峰。

SD大鼠单次ig 3.2g/kg达立通颗粒浸膏水溶液后，三种待测物在大多数组织广泛分布，其中大部分在15分钟和45分钟达到最高浓度，12小时后各待测物在大多数组织中基本消除。延胡索乙素在胃、肠和肝脏的分布浓度最高，其次是脂肪分布浓度，在结肠、心脏、脑、肾和其他组织的分布浓度相对较低。川陈皮素主要分布在肠道和胃，其次是肾脏，其他组织的分布浓度较低，大部分在4 小时后完全消除。木香烃内酯的分布浓度在胃和小肠中较高，其次是在结肠、肝和脾中的分布浓度。木香烃内酯的大部分组织分布浓度在15分钟时达到最高后随时间的推移逐渐降低。但在结肠组织中随时间增加，12小时木香烃内酯的分布浓度较高，表明该物质可能在多个肠段被吸收，这可能解释了血浆浓度时间曲线中的双峰现象。延胡索乙素和木香烃内酯也高度分布在肝脏中，表明它们可能主要通过肝脏代谢消除，而川陈皮素在肾脏张分布较高，可能通过肾脏代谢消除。

通过比较雄性和雌性大鼠ig达立通颗粒浸膏水溶液的后的组织分布情况，结果表明，雌性大鼠的总体组织分布浓度略高于雄性大鼠。此外，在大多数组织中，各分析物在雌性大鼠的组织分布浓度在15min时最高，而在雄性大鼠中延迟至45min，这表明各分析物的吸收和分布在雌性大鼠中较快。

六、讨论

达立通颗粒在临床上对功能性消化不良具有很好药效，但其体内主要药效成分和药效物质基础不够明确。为阐明此问题，在前期我们研究并鉴定体内存在成分的基础上，本研究建立并考证了一种快速的、具有较高选择性和可重复性的UPLC-MS/MS定量检测方法，用于同时测定大鼠血浆中的延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯。研究发现木香烃内酯提取效率低于80%，文献认为可能是由于木香烃内酯具有较高的血浆蛋白结合率。在木香烃内酯的稳定性考察中，发现木香烃内酯在血浆中不够稳定，考虑血清酯酶是降解的主要因素，控制血清酯酶活性，避免木香烃内酯中的酯键水解具有积极意义。事实上，我们发现样品采集后应尽快采用有机溶剂处理，再保存于4℃或者-20℃，或先在-70℃下，可以大幅减少降解比例。

本文建立的UPLC-MS/MS定量检测方法成功应用于达立通颗粒浸膏的药代动力学和组织分布研究。结果表明延胡索乙素、川陈皮素和木香烃内酯在大鼠体内的吸收、分布和代谢较为迅速，三种待测物在不同性别大鼠体内的药代动力学特征在ig给药后存在显著差异。川陈皮素的暴露量很低，只在雌性大鼠中检测到。雌性大鼠血药浓度达到峰值的时间相对较快，Tmax和T1/2等参数与前人研究结果接近。与单次较高剂量（6.4g/kg）给药相比，较低剂量（3.2g/kg）多次给药后，三种物质的体内暴露水平相当，提示多次给药能明显提高药物成分体内浓度，有利于达立通颗粒药效作用的发挥。

值得注意的是，与其他研究结果相似，木香烃内酯的药代动力学曲线显示明显的双峰现象，有学者提出木香烃内酯的双吸收峰是由肠肝循环造成的，考虑到木香烃内酯在肠肝循环过程中，在血清酯酶和肝脏丰富酶系的代谢下难以存在大量的（代谢）逃逸，而达立通颗粒浸膏中存在多种木香烃内酯类似物，存在体内代谢转换，导致木香烃内酯类吸收达峰和代谢转化生成达峰二个高点。另外与Zi-Wei Yu等人的研究发现给药木香烃内酯和去氢木香烃内酯混悬液（62.9mg/kg）30分钟后可以在结肠组织中检测到较高的组织分布浓度结果有所不同，我们测定结果显示给药后的45分钟之内，结肠组织未检测到木香烃内酯，只有4小时后结肠部分才出现木香烃内酯。提示此时木香烃内酯可以在结肠组织被吸收并形成二次浓度高点。

 

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