药物大多通过与人体内“靶点”分子相互作用而产生疗效。新的药物作用靶点是一系列新药发现的突破口，寻找药物作用的新靶点已成为当今创新药研发激烈竞争的焦点。从药物开发角度来看，药物的效果很大程度上取决于它的作用靶点。一些难以征服的疾病至今仍然没有理想的治疗药物就是因为到目前为止还没有找到合适的药物作用靶点。

药物靶点是指药物与机体内生物大分子的直接结合部位，主要包括受体、酶、离子通道、转运体、核酸等生物大分子，药物分子通过作用于药物靶点并调控药物靶点的生物学功能进而发挥其作用。此外，有些药物通过其理化作用或补充机体所缺乏的物质而发挥作用。现有药物中，超过50%的药物以受体为作用靶点，受体成为最主要和最重要的作用靶点；超过20%的药物以酶为作用靶点，特别是酶抑制剂，在临床应用中具有特殊地位；6%左右的药物以离子通道为作用靶点；3%的药物以核酸为作用靶点；20%药物的作用靶点尚有待进一步研究。

现代新药研发的关键是首先要寻找、确定药物作用靶点。发现并鉴定新颖的药物作用靶点是新药开发的首要任务。迄今已发现并鉴定的药物作用靶点约500个，其中受体尤其是G-蛋白偶联的受体（GPCR）靶点占绝大多数，另外还有酶、抗菌、抗病毒、抗寄生虫药的作用靶点。合理药物设计可以依据生命科学研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶点，或其内源性配体以及天然底物的化学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药。现代小分子化学新药大部分是基于已知靶点进行设计，靶点较为明确。因此，鉴定小分子药物的作用靶点对于新药设计、理解小分子药物的作用机制和应用有着至关重要的作用，同时也可以进一步发现小分子药物的脱靶靶标、脱靶效应、副作用以及靶点生物大分子参与的生物学功能。

药物作用靶点的鉴定不仅可以建立药物活性与细胞表型或位点生物学功能之间的联系，阐明药物的作用机理，还可以发现药物的脱靶效应和耐药机制，发现治疗药物的新靶点，并在药物发现的早期阶段预测潜在的副作用和毒性，从而降低药物研发失败的风险。常规的药物靶点鉴定一般采用基于化学修饰的方法和基于表型分析的方法。化学修饰方法包括亲和层析、活性位点定向探针技术和蛋白质微阵列技术等。但基于化学修饰的方法存在一定的局限性，其均需对小分子药物或蛋白质库进行标记或衍生，而小分子药物可能缺乏用于共价交联的位点，或者化学修饰会影响药物与靶蛋白的结合。另外，通过细胞表型筛选的药物发现策略更容易得到原创新药，而且有利于开发众多发病机制尚不明确的疾病治疗药物。但是，基于细胞表型的筛选无法提供活性化合物作用的靶标信息，需要回溯鉴定那些因与小分子药物直接发生作用而引起功能改变的蛋白质。药物作用靶点的发现和鉴定充满挑战，目前还没有一个完美的方法可以快速准确找到靶标，但科学家已经开发了众多行之有效的药物靶点发现和鉴定方法。除了标记类小分子药物作用靶点发现和鉴定技术外，非标记、非化学修饰小分子药物作用靶点发现和鉴定技术也已在新药研发中得到应用。

一、药物靶点

（一）酶

酶是由机体细胞产生的具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。由于酶参与一些疾病的发病过程，在酶催化下产生一些病理反应介质或调控因子，因此酶成为一类重要的药物作用靶点。药物以酶为作用靶点，对酶产生抑制、诱导、激活或复活作用。此类药物多为酶抑制剂，全球销量排名前20位的药物，有50%是酶抑制剂。例如奥美拉唑通过抑制胃黏膜的H﹢-K﹢ATP酶，抑制胃酸分泌；喹诺酮类抑制DNA回旋酶，影响DNA合成而发挥杀菌作用；卡托普利抑制血管紧张素Ⅰ转换酶；西咪替丁抑制肝药酶。苯巴比妥诱导肝药酶；解磷定使被有机磷酸酯类所抑制的胆碱酯酶复活等。有些药物本身就是酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶。也有一些药物是酶的底物，需经转化后发挥作用。例如左旋多巴通过血脑屏障后，在纹状体中被多巴脱羧酶所代谢，代谢产物多巴胺发挥补充中枢递质的作用。磺胺类通过与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，妨碍二氢叶酸的合成，抑制细菌体内叶酸的代谢而干扰核酸的合成。

（二）基因

现代遗传学家认为，基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA片段。近年来，随着基因研究的不断深入，人类基因组计划的实施，某些疾病的相关基因陆续被找到。基因治疗是指通过基因转移方式将正常基因或其他有功能的基因导入体内，并使之表达以获得疗效。1990年人类历史上首次成功地进行了腺苷脱氨酶缺陷患儿人体基因治疗试验，掀起了人类医学史上的一次革命。迄今，全世界已经批准了近600个基因治疗临床试验。如囊性纤维化是常染色体隐性遗传病，其基因定位在7q22.3—q23.1。患者受损细胞的氯离子转运异常，以肺部受累为多见。临床试验方案一般采用腺病毒和阳离子脂质体为载体，将编码CF跨膜导电调节因子基因导入患者呼吸道上皮细胞，治疗后基因转移部位的氯离子转运缺陷可获得纠正。与基因治疗不同，基因工程药物是指应用基因工程技术生产的药品，这类药物是将目的基因与载体分子组成重组DNA分子后转移到新的宿主细胞系统，并使目的基因在新的宿主细胞系统内进行表达，然后对基因表达产物进行分离、纯化和鉴定，大规模生产目的基因的表达产物。已应用的产品有人胰岛素、人生长素、干扰素类、组织纤溶酶原激活剂、重组链激酶、白介素类、促红细胞生成素等。核酸药物是指在核酸水平上发挥作用的药物。干扰或阻断细菌、病毒和肿瘤细胞的核酸合成，就能有效的杀灭或抑制细菌、病毒和肿瘤细胞。以核酸为作用靶点的药物主要包括一些抗生素，如利福平、利福定和利福喷丁等利福霉素类抗生素，作用机制是影响RNA的合成；抗病毒药阿昔洛韦、阿糖腺苷等，作用机制是干扰DNA的合成；喹诺酮类抗菌药如环丙沙星、氧氟沙星等，作用机制是阻断DNA合成；抗肿瘤药物如环磷酰胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素等，作用机制是破坏DNA的结构和功能等。

（三）离子通道

离子通道由肽链经多次往返跨膜形成的亚基组成。主要的离子通道有钙离子、钾离子、钠离子及氯离子通道，能调节细胞膜内外无机离子的分布，这些离子通道目前均已被克隆。通道的开放或关闭影响细胞内外无机离子的转运，能迅速改变细胞功能，引起神经兴奋、心血管收缩或腺体分泌。有些药物通过激活受体调控离子通道，例如激活N胆碱受体可引起钠离子通道开放，激活GABA受体可引起氯离子通道开放，激活α肾上腺素受体可引起钙离子通道开放等。有些离子通道就是药物的直接作用靶点，药物通过改变离子通道的构象使通道开放或关闭。例如阿米洛利阻断肾小管钠离子通道，左氨氯地平阻断钙离子通道，吡那地尔激活血管平滑肌钾离子通道等。

（四）免疫系统

正常免疫应答反应在抗感染、抗肿瘤及抗器官移植排斥方面具有重要意义。影响免疫功能的药物是通过影响免疫反应的一个或多个环节而发挥免疫抑制或免疫增强作用。某些药物本身就是免疫系统中的抗体（如丙种球蛋白）或抗原（疫苗）。免疫抑制药如环孢素，可用于器官移植和治疗其他药物无效的难治性自身免疫性疾病。免疫增强药多作为辅助治疗药物，用于免疫缺陷疾病，如艾滋病、慢性感染及恶性肿瘤等。

（五）转运体

转运体是存在于细胞膜上的蛋白质成分，能促进内源性递质或代谢产物的转运过程。转运体是细胞内外物质转运的分子基础，包括离子转运体、神经递质转运体、营养物质转运体以及外来物质转运体。有些药物可通过对某种转运体的抑制作用而产生效应，例如丙磺舒竞争性抑制肾小管对弱酸性代谢物的主动转运，抑制原尿中尿酸再吸收，用于痛风的防治。再如利尿药呋塞米及氢氯噻嗪抑制肾小管对钠离子、钾离子及氯离子再吸收而发挥利尿作用，可卡因及三环抗抑郁药抑制交感神经末梢对去甲肾上腺素摄取引起的拟交感作用，都是通过作用于转运体产生效应。药物转运是机体对药物处置的重要环节。药物转运体本质上属于外来物质转运体，是机体内物质转运系统的组成部分。药物转运体在药物吸收、分布、代谢、排泄等体内过程中起非常重要的作用，是影响药物效应以及产生药物相互作用的重要因素。根据药物的转运方式，药物转运体分为外排和摄取性两种。前者包括以多药耐药基因为代表的ABC转运体；后者主要包括以有机阴离子转运多肽1B1为代表的有机阴离子转运蛋白。近年来，对药物转运体的了解逐步深入，成为药理学研究中不可忽视的一个组成部分。

二、理想的药物靶点特征

一个理想的药物靶点应该是安全、有效且符合临床和商业的要求，并且具有“可成药性”。理想的药物靶点一般具备以下特征：

1、可以单独存在或形成聚合体。

2、具有可以与其他结构物质相结合的部位或位点。

3、其结构可以发生变化，发挥生理、病理调节作用，并在复杂的调节过程中起主要作用。

4、存在内源性与之结合的小分子或外源性配基，该配基具有药理活性。

三、用于药物作用靶点发现和鉴定研究的生物样本

作为药物研发极为关键的一环，发现并鉴定潜在治疗靶点的功能及其在疾病中的作用是靶点发现和特征鉴定的开始。用于药物作用靶点发现和鉴定研究的生物样本一般为基因、蛋白质、细胞，其流程一般是先利用基因水平、蛋白水平、细胞水平等技术获取疾病相关的生物分子信息，并进行生物信息学分析；再对相关的生物分子进行功能研究和特征鉴定，从而确定药物靶标。

从具体方法说，目前已有各种不同的技术手段从基因水平、蛋白质水平、细胞水平来寻找药物作用靶点，这些包括分子探针技术、表型分析技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、转基因生物技术、成像技术、生物标志物技术等。

（一）从基因水平来寻找药物作用靶点

下一代测序（NGS）技术能对人类群体的基因型-表型关系进行高通量分析，以遗传学为依据进行药物开发，能同时对百万条，甚至更多的DNA进行测序，并可实现在相对较低成本下对多基因、全外显子，甚至全基因组进行多种变异类型检测，且所需样本量和检测周期不会增加。

NGS在靶点发现中的应用主要有两种方式：一种是对目标人群的基因测序可以同时揭示多种疾病或特征的表型特异性药物靶标；另一种是NGS可以鉴定定量表型极端值与罕见变异的关联来识别特定表型的基因靶点。

（二）从蛋白质水平来寻找药物作用靶点

人体中所含蛋白质的种类远远超过人类基因的数目，一个基因由于有不同的剪切方式可以同时编码几种或更多种蛋白质，而且目前已知的药物靶点中，绝大多数为蛋白质。因此，从蛋白质层面寻找药物作用靶点，是药物研发的重要方向。

从蛋白质水平发现和鉴定药物作用靶点通常采用的策略是比较疾病状态和正常生理状态下蛋白质的异常表达，从而寻找药物作用的靶标。质谱技术已经成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具及核心技术。

（三）从细胞水平来寻找药物作用靶点

基于细胞的高内涵药物作用靶点发现是通过使用高通量活细胞成像技术来筛选复杂细胞系统中的化合物，能实现在单细胞水平上对化合物多靶点、多参数的同步检测，可以获得丰富的生物学信息，包括单个细胞图像和各项指标、细胞群体的统计分析结果、细胞数量和形态的改变、亚细胞结构的变化、荧光信号随时间的变化、荧光信号空间分布的改变等各方面的信息。

高内涵筛选可以从疾病相关基因调控通路和网络水平上研究药物的作用机制、代谢途径和潜在毒性等；同时，可以帮助深入了解化合物或亚细胞群复杂的相互作用，使在细胞水平全面评价化合物的成药性成为可能。

高内涵筛选克服了常规成像操作复杂、检测速度慢、检测时间长、数据分析复杂的缺点。通过有效结合高速多通道共聚焦成像检测技术及强大的数据分析功能，高内涵细胞成像分析技术能够快速、批量、自动地捕获细胞、亚细胞或组织图像，并对细胞表型进行量化处理，批量实现从图片信息到数字信息的转换，以及高通量图像信息的自动提取和分析。

四、药物作用靶点发现和鉴定技术

小分子药物作用靶点的发现和鉴定流程一般是首先获取与疾病相关的生物分子信息，然后研究这些分子的功能以确定药物作用靶点，最后针对靶点设计化合物进行有效性验证。目前，化学小分子作用靶点的发现和鉴定方法多种多样，各具优劣，既有独立性，又有互补性，其结合运用能更有利于化学小分子药物作用靶点的发现和鉴定。以下简要介绍常用的化学小分子药物作用靶点发现和鉴定技术。

（一）以基因组学为基础的药物作用靶点发现和鉴定方法

以基因组学为基础的药物作用靶点发现和鉴定方法主要分析化学小分子对基因组表达的影响，获得小分子作用的特征表达谱，通过分析确定分子靶点。但由于基因表达与蛋白质表达之间的对应关系存在一定的不确定性，不能直接确定药物作用的靶点，因此存在一定的局限性。

1、基因芯片技术

基因芯片技术在DNA测序、基因表达分子与基因调控机制研、基因药物设计与筛选等方面广泛应用。

2、特征基因及人工构建菌株

基因表达谱存在较多无效信息和干扰信息，通过一定的选取可发掘在相应组织（如肿瘤组织）中特异性表达的基因和药物治疗的靶序列。特征基因集合建立后，联合人工构建菌株技术，用这些基因构建相关预测菌株，这些预测菌株的基因表达可直接揭示相关药物的作用机制。近年来，基因组测序技术的发展促进了高通量研究，由于对酵母菌的生理学特点较为清楚，且酵母菌具有繁殖周期较短等特点，使酵母菌迅速成为寻找新药和研究药物作用机制的重要工具。随着分子条形码技术的发展，从以微阵列为基础的分析到下一代测序，使得单倍剂量不足分析和纯和性缺失分析的数据分析更加灵活、动态范围更大、检测范围更广。

3、生化抑制策略

在基因组中，由一个基因突变引起的表型改变可被其他基因的过表达消除，该现象是化学抑制策略的基础。生化抑制策略是用化学抑制剂作为“突变基因”，而其他部分纯化的蛋白混合物作为一种“过表达蛋白”，以此研究相关化学抑制剂的作用方式与靶点。生化抑制策略虽然可用于确定抑制性靶点以及信号通路中的其他化合物，但也有局限性，仅可应用于可融合、可片段化的蛋白质，该方法并不适用于对疏水性蛋白质的研究。

（二）以蛋白质组学为基础的药物作用靶点发现和鉴定方法

以蛋白质组学为基础的药物作用靶点发现和鉴定方法主要是寻找小分子作用的靶蛋白质，将其分离纯化，由此确定小分子药物作用的靶点，为其作用方式提供直接证据。

1、蛋白质差异表达的应用

化学小分子作用前后细胞蛋白质的种类和数量发生了变化，通过对差异表达的检测可以估计小分子化合物的作用方式，筛选出相应的靶点。

（1）荧光差异二维凝胶电泳技术

相对于普通凝胶电泳，荧光差异二维凝胶电泳技术可在一块丙烯凝胶上直接比较两种蛋白质样本，避免了两块凝胶比较时可能产生的系统误差。此外，可以定量分析大量修饰过的蛋白，提供结构和翻译后的修饰信息，使重要生物系统变化的鉴定和蛋白质功能的阐述得以实现；同时可以定量分析截短的或部分降解的蛋白质。但由于疏水蛋白、膜蛋白以及等电点或极端大或小分子量的蛋白质难以保持溶解状态，因而难以用此法鉴定。此外，荧光差异二维凝胶电泳技术难以区分具有相似分子量和等电点的蛋白质。

（2）色谱共洗脱

配体-靶点复合物在高效液相色谱共洗脱加上配体-靶蛋白结合导致化合物色谱滞留时间的特征性转移，从而可用高效液相色谱法-质谱/质谱法来确定靶蛋白。运用该法虽然可以免去对化合物或蛋白质进行固定或标记，但由于需要分离未结合和结合的化合物，导致共价结合物被排除在外。此外，该方法需要溶解较多的靶蛋白，使药物和靶蛋白的反应受到限制。

2、蛋白质亲和特性的应用

蛋白质亲和特性的应用是利用分子间的特异性结合进行蛋白质的分离和纯化。目前的亲和纯化技术主要有亲和层析技术、串联亲和纯化法、细胞培养稳定同位素标记法、小分子探针以及蛋白质芯片技术等。

利用蛋白质亲和特性研究药物与靶蛋白的结合，需要对药物分子进行构效关系研究，但无需了解药物与靶蛋白之间可能发生的某些特定的细胞或生化反应，研究可能受药物小分子衍生物的限制，合适的可作为阴性对照的化学小分子药物也较难得到。

（1）细胞培养稳定同位素标记法

细胞培养稳定同位素标记法是在细胞培养过程中利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白质的表达进行定量分析的一种体内代谢标记技术。量分析的一种体内代谢标记技术。目前标记的氨基酸的种类已扩展到亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸等。作为体内代謝谢标记技术，其标记效率高，不需要对样品进行预处理，具有高通量性，且样本需求量少、操作简单、定量精确，适用于大分子量、复杂生物样品的分析，可以鉴定出更多低丰度蛋白，包括细胞表面蛋白、细胞器特异性蛋白、磷酸化蛋白或糖蛋白等经翻译后修饰的蛋白。但该方法也具有一定的局限性：

①实验中需要将单个蛋白分离纯化，导致误差较大;

②不相关的共洗脱的离子发生同位素聚集，使定量分析复杂化；

③为了保证同位素标记的氨基酸混合的完整性，限制使用处于高水平复制的细胞；

④不能使用人体或其他组织样本。

（2）小分子探针

小分子探针主要由报告基团、连接基团以及活性基团组成，作用原理是小分子活性基团部分与靶标紧密结合，而报告基团部分可有效标记靶标生物大分子，之后可通过亲和层析、凝胶电泳和质谱分析等手段确认靶标蛋白。传统探针要求探针分子与靶蛋白不可逆结合，但由于报告基团体积较大，有可能阻碍细胞对探针的吸收，影响探针的分布及其亲和力，故出现了不带报告基团的bio-orthogonal探针，先用不带报告基团的探针与靶标蛋白共价结合，再通过bio-orthogonal反应将被标记的蛋白与报告蛋白连接，避免因报告基团（生物素、荧光基团等）体积过大而影响探针分子在细胞内的分布以及对靶标的亲和力，方便在活细胞内的研究。但小分子探针确定靶标也具有一定的局限性：

①细胞内丰度低或与探针结合力弱的蛋白难以鉴定；

②探针与杂蛋白非特异性结合具有一定的干扰作用，采用高强度洗脱和阴性对照可消除一定的影响；

③需要对化合物进行构效分析，且合成的探针分子应保持原有的生物活性和作用机制，所以工作量大且需要丰富的医药化学专业知识：

④为了将化合物与连接链和报告基团连接，通常还需要在化合物母核上引入氨基、羟基、羧基等官能团，这些基团的引入可能对化合物的活性产生影响。

（3）蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术是将一个蛋白质库以二维可设定位置的网格格式固定在一个载玻片或芯片上，可测定亲和力低和含量低的蛋白质。由于蛋白质会变性，因此在蛋白质芯片的制造过程中要保证蛋白质的构象和功能，并且要表达和纯化大量正确折叠且有活性的蛋白质，蛋白质芯片耗时长，实验要求高，制造难度远远高于基因芯片。

根据实验样品的添加顺序，蛋白质芯片技术可分为正相芯片技术和反相芯片技术。正相芯片技术具有高特异性，但十分耗时，且需要大量的蛋白质探针；反相芯片减少了检测蛋白质抗原所需的抗体探针的量，但对于相对低浓度样本中靶蛋白的敏感性降低。

近年来一些新的蛋白质微阵列技术如巨磁阻检测芯片技术（灵敏度高，巨大磁抗性传感器定量分析并用磁纳米微粒标记），蛋白直接由微阵列上的核酸进行表达的核酸可控蛋白芯片技术（庞大的蛋白质库）等也逐步被应用。

3、蛋白质稳定性的应用

基于靶蛋白与小分子结合后稳定性变化，包括抗酶解活性、热稳定性等，发展出了一系列小分子靶标的筛选鉴定方法。

（1）蛋白质抗酶解活性

小分子化合物与蛋白质的结合可能会掩盖蛋白酶的剪切位点或结合小分子后的靶蛋白局部或整体构象的稳定性增加，对蛋白酶的易感性下降，导致结合小分子的靶蛋白可能较未结合状态的靶蛋白不易被蛋白酶降解。基于这个原理，发展出药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）研究方法。细胞裂解液与小分子化合物混合，裂解液中蛋白质被嗜热菌蛋白酶和链霉蛋白酶裂解，通过免疫印迹法分离出因为与小分子结合而未被裂解的蛋白质，最后进行质谱分析，确定靶蛋白。

相对于亲和色谱分析法，DARTS技术中小分子化合物不需要经过构效分析或对配体进行化学修饰。可以联合使用DARTS与多向蛋白质鉴定技术，进一步增加检出靶蛋白的灵敏度。

（2）氧化速率的蛋白稳定性

氧化速率的蛋白稳定性（SPROX）技术与DARTS类似，DARTS利用的是蛋白质不同的水解特性，而SPROX利用的是不同的折叠状态和热力学稳定性。小分子化合物与靶蛋白结合后可能对靶蛋白的折叠状态以及热动力学稳定性产生影响而使靶蛋白发生变化。一定时间和一定浓度的化学变性剂存在时，蛋白质的甲硫氨酸残基只发生部分氧化，不同折叠状态的蛋白质氧化程度不同，即可以通过氧化速率反映蛋白质的不同折叠状态。

但SPROX也具有一定的局限性：

①只能准确检测样本中含量较高的蛋白质靶标；

②只有含有甲硫氨酸的蛋白质才适用这个方法，即使含有甲硫氨酸，也并非所有的甲硫氨酸残基都会展现出不同的氧化速率足够用来确定热动力学稳定性的改变。

（3）蛋白质热稳定性

Martinez Molina等将临床药物作用于细胞裂解液中4个不同的靶蛋白时发现，所有的靶蛋白都有其独特的熔解曲线，当已知可结合到这些蛋白上的药物加入细胞裂解液中，可以观测到明显的熔解曲线移动，根据这一原理开发出细胞热转移（CETSA）方法，其可以直接测量药物到达靶细胞的程度，检测小分子在细胞裂解液甚至完整细胞组织中的作用。

CETSA适用范围广，可在细胞水平和动物水平直接测量药物分子是否到达作用靶点，验证了重要的临床药物靶标。根据药物在体内和体外与靶标结合时间、结合程度的差异，可进一步研究小分子药物在体内转运激活的过程。Savitski等通过对人K562细胞进行热力学蛋白质组分析，观察到完整细胞和细胞裂解液的熔解特性存在差异，用抑制剂十字孢碱和CSK3182571验证了蛋白质组分析的可行性。同时确定了亚铁血红蛋白生物合成酶亚铁鳌合酶是多种激酶抑制剂的脱靶蛋白，进一步解释了原卟啉症患者畏光的可能原因。此外，采用此方法研究发现，药物达沙替尼导致了慢性髓系白血病BCR-ABL信号通路下游蛋白的热转移。

但CETSA也有局限性。CETSA的蛋白熔解曲线是基于靶蛋白与小分子结合后热稳定性增强这一特性建立起来的，而大的蛋白质包括蛋白质复合物有可能没有这种小分子引起的反应或者反应微弱。此外，加热可能会导致小分子与血浆蛋白结合和细胞通透性改变等，所以应尽可能地缩短加热时间，减少样本量或彻底改变样本几何学特性以及加热装置以改善热传递。另外，若小分子参与细胞快速反应信号通路，则有可能影响蛋白的翻译后修饰，所以细胞与小分子化合物的预先孵育时间会影响抗体对靶蛋白的检测能力。一些蛋白质的配体结合位点的结构域未折叠，也无法通过CETSA进行靶标鉴定。

（4）热蛋白质组分析技术

热蛋白质组分析（TPP）技术是将CETSA技术与多重定量质谱法相结合而发展起来的药物作用靶点发现和鉴定技术，大大提高了蛋白质检测的通量和分析速度，因此TTP技术又被称为MS-CETSA技术。TPP技术通过在单次LC-MS/MS实验中同时监测10个不同温度下全蛋白质组的热稳定性变化，可获得大量可溶性蛋白的热熔曲线、不仅可用于药物靶点的发现，还可以用于检测药物的脱靶效应，以及药物﹣靶蛋白的相互作用模式研究。与CETSA技术一样，TPP技术可以用于完整活细胞及细胞裂解液水平的研究，通过将这两个水平的样品所得结果进行综合分析，可区分药物的直接作用靶点及通过影响上下游信号通路而发挥作用的间接靶点。除此之外，TPP也是绘制代谢途径的有效工具，可用于翻译后修饰、蛋白质﹣蛋白质相互作用的研究及蛋白质基本功能的阐述，进而绘制出更全面的蛋白质相互作用网络，例如在翻译后修饰方面的研究，蛋白质的磷酸化会影响蛋白质的热稳定性，其修饰前后的热稳定性差异可以用TPP测量。

由于CETSA及TPP技术为了保持蛋白的活性，依赖于使用不含洗涤剂的缓冲液提取细胞蛋白，而无法获得足够的膜蛋白，因此，在CETSA和TPP实验中引入非变性洗涤剂（NP-40），扩大了对膜蛋白覆盖率，通过改良后的方法成功识别出毒毛旋花苷G的膜蛋白靶点钠钾离子泵。此外，CETSA及TPP技术在低丰度蛋白质的检测方面存在限制，研究者通过将亚摩尔浓度的亲和纯化蛋白复合物样本作为TMT复用器中的等压触发通道引入到突变TPP（mTPP）技术中来促进热蛋白质组分析实验中低丰度蛋白质的检测，可用来获得基于TPP或mTPP技术遗漏的蛋白质的热分析数据。许多生物学相关、疾病相关的蛋白质在细胞中的丰度相对较低，该方法在蛋白疾病标志物及低丰度的靶点蛋白发现方面具有很大潜力。

在CETSA及TPP技术中，为保证数据的可信度，通常需要至少10个温度点的样品，若增加重复次数或不同处理条件，样品数量将达到几十甚至几百个，虽然TPP通过多重定量质谱法实现了高通量分析，这庞大的分析通量依然是一个巨大的挑战。基于此，研究者们提出了“合并为一锅”策略，命名为蛋白质组整体溶解度改变校术（PISA），并将其与TPP联用，称为PISA-T。此策略通过将多个加热温度点的样品等量混合成为单个合并样品再进行分析，并将CETSA测定热融曲线的“位移变化”转变为“积分变化”，这种策略不仅减少了分析样品数量，增加了筛选靶蛋白的特异性，同时也减少了分实验误差，但样品的合并减小了单个样品的差异值，一定程度上导致原有筛选炅铁度的降低。

CETSA及TPP技术通过分析蛋白质组样品在高温处理下的可溶性上清蛋白进行药物靶蛋白筛选，而变性沉淀的部分一真未受到重视。配体稳定靶点识别技术（TILS）将研究对象转变为加热之后产生的不可溶沉淀部分，成为CETSA及TPP技术的补充方法，但低效的样品处理程序阻碍了沉淀的分析，近来研究报道了一种微球辅助的热致沉淀分析方法（MAPS），通过在加热之前向体系中引入足量的微球材料，未结合小分子配体的蛋白质结构展开后将聚集在微粒表面，而结合小分子配体的蛋白质结构展开需要相对较高温度，通过分析聚集在微粒表面蛋白的差异来识别小分子药物的靶点。在样品前处理步骤中，MAPS技术采用快速、高通量的SP3（SP3）法并在微粒的表面运行。根据该方法，将沉淀在微粒上的蛋白质进行洗涤、还原、烷基化、消化及除盐处理，整个样品制备过程均在微粒表面进行，不涉及任何样品转移，样品损失较少，更加适用于微量样品。在数据处理方面，开发了灵敏度更高的处理方法，不再依赖于绘制热熔曲线，而是以通过比较有无小分子配体存在的整体稳定性差异，并整合多个温度点的数据，进而放大了热稳定性变化的差异，相较于TPP技术，MAPS具有更高的特异性。此外，近来有学者将TPP热处理得到的上清和沉淀中含有配体诱导的蛋白稳定性转移的互补信息进行有机整合，开发了一种沉淀支持的TPP（PSTPP）分析方法，用于在蛋白质组水平上对蛋白质﹣药物相互作用进行无偏和全面的分析。在PSTPP技术中，只使用蛋白质沉淀显著的温度来诱导蛋白质变性，并利用上清组分和沉淀组分中包含的互补信息来提高筛查的特异性和灵敏度。除此之外，还提出了一种新的基于深度学习的图像识别算法来识别目标蛋白，克服了热熔曲线拟合策略存在的问题。

由于CETSA及TPP技术均需多个温度点，研究者开发了等温位移分析（iTSA），此方法可在单一温度点下进行热稳定性测定，通过增加样品的重复次数、可使靶蛋白鉴定的统计学可信度达到与CETSA/TPP相似的效果，iTSA具有更高的通量选择、更简单的实验设计及工作流程，相较于CETSA/TPP，iTSA是一种更高效的方法，但由于该方法中增加的样品重复次数，此方法并不能大幅度减少所需分析的样品数，且可能会因温度过于单一导致错误识别，例如识别出脱靶后结合的蛋白。

CETSA类靶点发现技术是目前应用最为广泛的非标记靶点发现技术，且在近年来得到快速的发展。

（三）基于克隆扩增的鉴定方法

1、三杂交系统

目前主要有两种三杂交系统：酵母三杂交系统和哺乳动物三杂交系统，前者是在酵母中进行，后者是在哺乳动物中进行。在三杂交系统中，DNA结合域与转录激活域的相互作用是通过小分子化合物的桥联完成的，互补DNA编码的靶蛋白可直接通过这种方法进行分离鉴定。但未正确折叠和转录后修饰的靶蛋白、膜结合蛋白和部分蛋白质复合物无法鉴定，并且杂交的配体必须能够进入母细胞并保持活性。

2、显示技术

显示技术包括噬菌体显示法和mRNA显示法等。噬菌体由于对其配体的特异亲和性而不断得到富集，因此噬菌体显示法可检测微弱表达的蛋白，并能确定其亚结构域与结合的关系。但有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运等，导致无法在噬菌体中获得表达，限制了噬菌体显示法的应用。

mRNA显示法是将mRNA与其编码的多肽用嘌呤霉素连接融合，该融合物被纯化，经过逆转录得到cDNA以进一步扩增、表达，之后与固定于固相载体上的小分子共同孵育以鉴定。但在表达、克隆及显示的过程中产生的多肽大多具有毒性，因此mRNA显示法同样存在局限性。

（四）其他药物作用靶点发现和鉴定方法

1、比较分析研究的鉴定方法

随着用小分子处理细胞得到的可用数据逐渐增多，化合物的特有“指纹”如基因表达、蛋白组谱、表型的多参数分析、细胞毒性数据的收集成为可能，由此形成的数据库可通过相似性比较，识别当前小分子的靶标，其是目前最有效的识别药物的方法之一。

2、副作用报告系统的鉴定方法

化学小分子靶标的鉴定不仅可用于阐明相关化合物的作用方式，也可用来识别所谓的“脱靶”蛋白，即化学小分子作用的靶标以外的蛋白。药物小分子与“脱靶”蛋白结合，产生不良反应甚至生物毒性。Takarabe等的利用副作用报告系统定义了所有药品的药理学相似性，同时运用靶蛋白基因组序列的相似性发明了一种可以在大范围预测未知药物﹣靶标反应的方法，特别是针对那些无法预知药物化学结构的未知反应，并对1874种有已知靶标的药物的“脱靶”蛋白以及2519种靶标未知的药物的可能靶标进行了综合性预测。

3、溶剂诱导蛋白沉淀技术

丙酮、乙醇、甲醇和乙腈等落剂通常用于沉淀蛋白质，而小分子配体﹣蛋白质复合物具有较低的能量状态，因此小分子配体﹣蛋白质复合物中的蛋白相较于游离蛋白质更能抵抗溶剂诱导的变性沉淀。基于这一原理，结合稳定同位素二甲基标记的蛋白质组学，提出了SIP技术。利用SIP技术成功地检测细胞裂解物中甲氨蝶呤、SNS－032和星形孢菌素的已知蛋白质靶标，验证了SIP方法的可行性，并利用SIP方法，成功鉴定了HSP90家族的三种已知蛋白和几种潜在的脱靶蛋白。

4、机械应力诱导蛋白沉淀技术

与热应力类似，机械应力也可以诱导蛋白质沉淀。在机械应力作用下，蛋白质会随着蛋白质构象的变化而逐渐沉淀，从而在微粒表面聚集，小分子配体﹣蛋白质复合物中的蛋白相较于游离蛋白质更能抵抗机械应力诱导的变性沉淀，通过对比微粒表面聚集的蛋白的差异，开发了一种用于药物靶点发现的MSIPP方法。基于MSIPP技术成功地发现了细胞裂解物甲氨蝶呤、雷替曲塞的已知蛋白质靶标，验证了SIPP方法的可行性，这也是首次通过非标记的药物发现技术证朋二氢叶酸还原酶是雷替曲塞的直接作用粑点。

5、基于离子的蛋白质组综合溶解度改变技术

现有的基于温度的蛋白质沉淀靶点发现方法存在许多限制因素，比如，有些蛋白并不会随着温度的升高发生去折叠产生沉淀，热熔曲线并不总是理想的S形，使得Tm的测定复杂化，近两年新提出的一些等温蛋白沉淀法（如SIP、MSIPP）仅适用于裂解液实验。基于此局限性，有研究者提出了I-PISA技术。某些阴离子、阳离子可以改变蛋白质溶解度，进而导致蛋白质沉淀，称之为基于离子的蛋白质沉淀方法。I-PISA技术将基于离子的蛋白质沉淀方法与PISA分析相结合，利用了蛋白结合药物后结构更加稳定，能够在一定程度上抵抗离子诱导沉淀的特性，通过对比药物孵育和溶剂孵育的裂解液得到的上清液中各蛋白的丰度，将药物孵育组显著增高的蛋白认定为潜在靶蛋白。I-PISA法对于细胞裂解液和完整细胞均适用，且可以检测微量蛋白的溶解度变化。

6、靶点响应性可及性变化谱技术

靶蛋白与小分子配体结合后，小分子配体结合域与靶点蛋白的活性口袋紧密结合，其诱导变构区域的氨基酸残基的可及性发生显著变化，该变化能够被还原烷基化等化学共价标记反应所捕捉，再利用质谱定量蛋白质组学手段对细胞内的全蛋白组进行分析，能够获得真实生物体系内小分子孵育后全体蛋白组的可及性变化信息，从中筛选出小分子诱导可及性变化最显著的蛋白即为小分子靶蛋白，该技术被称为TRAP技术。TRAP技术能够普适性的运用于多个小分子配体的高通量靶标发现，能够提供部分的配体结合位点的信息，并适用于与小分子存在弱结合的靶标发现。

五、展望

化学小分子药物作用靶点的发现和鉴定方法在药物研发和化学小分子药物作用机制的研究中发挥极其重要作用。相对于根据可能的靶点对下游物质产生效应进行推测的方法，直接鉴定更加准确。新近的研究技术，包括高通量的扫描、高灵敏度的质谱分析、化学探针、正电子发射断层成像技术、体内生物荧光成像技术等的发展促进了靶蛋白的分离和鉴定。

目前一种药物作用于多种蛋白的概念已被逐渐接受，药物的研发和合成并不只是针对致病基因和蛋白，而是研究整个药物作用和致病作用的网络。这对化学小分子药物作用靶点的发现和鉴定提出了更高的要求。随着基因组学、蛋白质组学、生物信息学、遗传学及生物技术等学科的持续发展，现有方法还会不断完善，新方法、新策略将不断涌现，届时可发掘出更多药物新靶点，明确相关靶点的药物作用机制，进而更好地研制高效安全的药物。