依据《中药复方制剂整体质量评价体系的构建及应用》中关于构建中药复方制剂整体质量评价体系的技术路线，按照《达立通颗粒整体质量研究方案》，开展达立通颗粒整体质量评价研究，包括研发立项研究、组方和方解研究、中药材/饮片质量研究、生产过程控制技术研究、作用机制研究、质量标志物和生物标志物研究、循证医学研究、药物经济学研究。根据项目进展情况，我们将陆续报道相关研究成果。本期介绍达立通颗粒中主要活性成分在正常及功能性消化不良模型大鼠胃肠道组织中的差异分布研究成果。

摘要  目的：研究达立通颗粒中主要活性成分在正常和功能性消化不良模型大鼠胃肠道组织中的分布差异。方法：应用超高效液相色谱-串联四级杆/线性离子阱质谱（UPLC-QTRAP-MS/MS）测定达立通颗粒中主要活性成分在大鼠胃肠道中的分布。采用夹尾刺激结合不规律饮食双因素干预方法建立功能性消化不良模型。采用ACQUITY HPLC HSST3色谱柱（2.1mm×50mm，1.8μm），柱温为40℃，以0.1%甲酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速为0.3mL/min，进样量为2μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），MRM数据采集模式。结果：建立的UPLC-QTRAP-MS/MS方法中，18个主要活性成分在生物样本中线性关系良好，相关性R平方≥0.99。对建立的检测方法进行专属性、精密度与准确度、提取回收率、稳定性和基质效应等方面的考察，均符合要求。结果表明，各成分在空白组和功能性消化不良模型组大鼠胃肠道组织中含量差异明显，且在各组织中达到最高浓度的时间点差异较大。正常大鼠胃组织中，各待测化合物基本在1h快速达到最高浓度。但在模型组中，上述化合物在胃肠道中的暴露水平有所降低，这可能与功能性消化不良引起的胃肠道蠕动减慢有关。此外，在不同肠段组织中，空白组和模型组各成分暴露量及暴露时间也有较大差异。结论：建立的定量方法灵敏度高、准确性好、专属性好，适用于大鼠胃肠道组织中达立通颗粒主要活性成分的组织分布研究。与空白相比，功能性消化不良模型大鼠组织分布具有显著性差异。

关键词  达立通颗粒；功能性消化不良；UPLC-QTRAP-MS/M

消化不良按照其疾病诱因可大致两类，包括“器质性”消化不良（OD）和“功能性”消化不良（FD）。后者FD属于排除明显的器质性、代谢性、系统性病变，具有伴餐后加重的上腹部胀痛、灼热、令人烦恼的反复出现的餐后饱腹感、气逆不顺、食欲低下、恶心、呕吐等症状。随着生活水平的不断提高，饮食习惯也在不断改变，消化系统类疾病的患病率、复发率呈现逐年增长的趋势，其中FD的占比逐年增高，对患者的精神情绪和生活品质造成极大影响。FD的治疗选择仍然有限，在大多数情况下只是对症治疗。

达立通颗粒是由南昌弘益药业有限公司生产的首个促胃肠动力中药，临床上用于治疗FD、胃轻瘫和慢性胃炎等胃肠综合征。达立通颗粒含12味中药，以柴胡和枳实为君药，柴胡始载于《神农本草经》，具有疏肝退热和升阳举陷的功效，其主要化学成分为三萜皂苷类，可促进胃肠蠕动，润肠通便，抑制胰蛋白酶、胃酸分泌及抗溃疡的作用；枳实主要化学成分为黄酮和挥发油类，可增加肠蠕动频率，行气以及抗炎的作用，具有破气消积和化痰散痞的功效。以木香、陈皮、清半夏为臣药，蒲公英、焦山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索、六神曲（炒）为佐药。山楂富含有机酸，有调理胃肠功能的作用；延胡索的主要成分为延胡索碱、延胡索乙素、紫堇碱、小檗碱等生物碱类，具有缓解疼痛和抑制胃酸分泌的作用。由于达立通颗粒中药材众多、所含化学成分复杂且难以分离，目前国内尚无全面的关于其给药后，达立通颗粒中的活性成分在胃肠道组织分布方面的文献报道。研究达立通颗粒中主要活性成分在正常及FD模型大鼠胃肠道组织中分布及差异，可为研究其药效物质基础提供一定的数据支撑，助力推动其现代化发展。

1 实验材料

1.1 仪器

ABSCIEXQ-TRAPTM6500质谱仪（美国ABSciex公司），LC-20A快速液相仪（日本Shimadzu公司），SpeedVac离心浓缩仪（美国ThermoScientific公司），ER-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司），BS214D万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司），KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），LeicaUC7超薄切片机（Leica），Ultra45°钻石切片刀（Daitome），HT7700透射电子显微镜（hitachi）。

1.2 试药

乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司），甲酸（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司），乙醇（分析纯，南京化学试剂股份有限公司），无水乙醇、丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），电镜固定液（批号G1102）由武汉赛维尔生物科技有限公司提供，纯水（实验室自制）。原儿茶酸（批号JOT-10315）、黄连碱（批号JOT-10440）、小檗碱（批号JOT-11648）、原阿片碱（批号JOT-10337）、伞形花内酯（批号JOT-11244）、牡荆苷4''-O-葡萄糖苷（批号JOT-11732）和白杨素（批号FX-10187）购自成都普菲德生物科技有限公司；橙皮苷（批号M05M8S35241）、木犀草素（批号YY20110606）和淀粉（批号S28078-500g）购自上海源叶生物科技有限公司；橙皮素（批号RFS-C01711811029）、木犀草苷（批号RFS-M02501909016）、木香烃内酯（批号RFS-M02211804027）、去氢木香内酯（批号RFS-Q01601906013）、甜橙黄酮（批号RFS-T04611812016）、川陈皮素（批号RFS-C01511803006）、桔皮素（批号RFS-J02211807030）、柚皮素（批号Y-030-190812）和柚皮苷（批号RFS-Y00611712016）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号F20101222）购自上海沪试实验室器材股份有限公司。活性炭（批号20120129）购自国药集团化学试剂有限公司。达立通颗粒（批号210342）由南昌弘益药业有限公司提供。

1.3 动物

雄性SPF级SD大鼠，体重180～220g，购自杭州医学院。实验动物生产许可证号为SCXK（浙）2019-0002。

2 实验方法

2.1 样品制备

2.1.1 达立通颗粒药液的制备

称取适量达立通颗粒研磨成细粉，加入纯水后超声振荡30min。配得浓度为2.8g/mL的达立通颗粒药液放凉，置于4℃冰箱保存待用。

2.1.2 混合对照品溶液的制备

精密称定上述18个对照品适量，分别溶于甲醇中作为储备液，吸取各对照品母液适量混匀制成混合对照品储备液，该储备液中各化合物质量浓度如下：原儿茶酸18.80μg/mL、黄连碱16.65μg/mL、小檗碱17.86μg/mL、原阿片碱15.03μg/mL、伞形花内酯14.97μg/mL、白杨素25.05μg/mL、橙皮苷15.20μg/mL、木犀草素15.02μg/mL、金丝桃苷22.70μg/mL、甜橙黄酮17.37μg/mL、木犀草苷15.02μg/mL、木香烃内酯15.02μg/mL、牡荆苷4''-O-葡萄糖苷15.87μg/mL、去氢木香内酯15.02μg/mL、去甲基川陈皮素15.2μg/mL、桔皮素15.85μg/mL、柚皮素18.55μg/mL、橙皮素14.65μg/mL、川陈皮素15.45μg/mL和柚皮苷16.40μg/mL。

2.1.3 混合内标溶液的制备

精密称定正离子模式内标化合物氟西汀和负离子模式内标化合物双氯芬酸适量，加乙腈制成浓度为300ng/mL的混合内标溶液。

2.1.4 实验餐的配制

实验餐配方如下：2.5gCMC-Na充分溶于50mL热水中制成透明粘稠半固体，分别依次加入4g脱脂奶粉和2g淀粉，充分搅拌均匀后加入1g活性炭，加水至62.5mL即得黑色半固体糊状实验餐。

2.2 动物实验

2.2.1 FD模型的建立及给药方案

48只SD大鼠，购入后适应性饲养7天。随机分为空白组和模型组。模型组大鼠均采用夹尾刺激结合不规律饮食双因素干扰建立FD模型，具体操作如下：为避免皮肤损伤，使用纱布包裹后的长海绵握钳，夹住大鼠尾巴远端三分之一处。每次刺激持续30min，每天4次（分别在9：00、12：00、15：00和18：00进行），伴随隔日禁食，连续14天。造模14天后，禁食不禁水18h，按22.4g/kg剂量（31.3g/70kg×6.3≈2.817g/kg，按照8倍临床等效剂量给药）给予达立通颗粒1次。

2.2.2 胃排空和肠推进实验

最后一次给药前18h撤走饲料但仍然自由饮水，禁食18h后给予每只3mL/kg实验餐（重量记为W实），40min后脱颈处死动物。迅速打开大鼠腹腔，结扎胃前后两端防止实验餐漏出，取出后称量获得胃全重（W全）。沿胃大弯一侧切开整胃，用生理盐水轻轻洗掉胃内实验餐残渣，拭干后称量胃净重（W净）。取大鼠整段小肠（包括十二指肠至回肠部分），平铺于白纸上，测量幽门至实验餐前沿（L前）及整段小肠的长度（L总），代入公式求得胃排空率和小肠推进率。随后取下十二指肠，同胃部组织一起储存于-80℃冰箱中待用。

胃排空率=（W全-W净）/W实×100%；

小肠推进率=L前/L总×100%。

2.2.3 胃肠组织病理学观察

将4%多聚甲醛固定后的胃窦组织进行石蜡包埋，常规操作制备蜡块后切片，采用H&E染色法制备病理切片，倒置荧光显微镜下观察。将电镜固定液4℃固定2～4h后的1立方毫米十二指肠切片，用PBS漂洗3次各15min，同样方法后固定。随后乙醇-丙酮梯度脱水，环氧丙烷置换10min，丙酮和812包埋剂渗透过夜后包埋。聚合后制成60～80nm超薄切片，铀铅双染色各15min，透射电镜下观察。

2.2.4 组织样品收集与处理

末次给药后1h，3h和6h收集各组大鼠的组织样品，包括：胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠。胃部组织和各肠管取出后立即放入生理盐水中洗去实验餐残渣和血液，拭干后置于5mL EP管中，-80℃冷冻保存。分别取各时间点下的组织样品约200mg置于2mL EP管中，加入800μLPBS制成匀浆，转移至5mL EP管中，加三倍量乙腈振荡10min以沉淀蛋白，于12000rpm离心2次，每次10min，随后取出上清液挥干，加入200μL乙腈（或含内标乙腈）溶解，12000rpm，离心10min后取上清液进样。

2.3 检测条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITYHPLCTMHSST3色谱柱（2.1mm×50mm，1.8m），柱温：40℃，流动相为0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脱：0～1min，20%B；1～2min，40%B；2～3min，60%B；3～8min，90%B；8～8.5min，20%B；8.5～10min，0。流速为0.3mL/min，进样量为2μL。

2.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），MRM数据采集模式，分别对各待测物离子对进行优化。离子源温度（TEM）550℃，气帘气（CUR）40psi，雾化气（GS1）60psi，辅助加热气（GS2）60psi，离子源喷雾电压（IS）4500V/-4500V。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性评价

取空白大鼠胃和各肠段组织样品、加入混合对照品溶液和内标的空白大鼠胃和各肠段组织样品以及大鼠给药1h后加入内标的胃和各肠段组织样品，按照“2.2.4”项下处理后，进行UPLC-QTRAP-MS/MS进样分析。

2.4.2 线性关系考察

取一系列浓度的混合对照品溶液按2.3项下条件测定。以各待测化合物浓度为横坐标（X），以化合物与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），进行线性回归分析并绘制标准曲线，并按信噪比（S/N）=3测定各成分的检测限（LOD），S/N=10测定各成分的定量限（LOQ）。

2.4.3 精密度与回收率

配制低、中、高三个浓度的质控样品，进行精密度考察，批间精密度在批内的基础上连续考察3天。另按上述方法配制质控样品进行提取回收率检测。2.4.4 稳定性考察

取空白大鼠胃和各肠段组织样品，配制低、中、高三个浓度的混合对照品溶液（n=6），按“2.2.4”项下处理。按2.3项下条件分别检测常温放置8h，自动进样器放置24h，-80℃和常温反复冻融3次以及冻存2周后样品的稳定性。

2.4.5 基质效应

取6份来源不同的空白大鼠胃及肠组织，经“2.2.4”项下处理后，分别加入低、中、高三个浓度的质控样品。按2.3项下条件进样后所得峰面积比上对应浓度对照品与胃肠组织匀浆液等体积混合后所得峰面积比值为基质因子。

3 实验结果

3.1方法学考察

3.1.1专属性评价

本实验检测条件下，牡荆素-4''-O-葡糖苷、原阿片碱、黄连碱、小檗碱、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、去甲基川陈皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯、氟西汀、原儿茶酸、木犀草苷、伞形花内酯、橙皮苷、木犀草素、柚皮素、橙皮素、白杨素和双氯芬酸出峰保留时间分别为：1.75min、2.21min、2.55min、3.00min、4.22min、4.49min、4.78min、5.07min、5.43min、5.58min、3.78min、1.51min、1.86min、1.94min、2.28min、3.10min、3.58min、3.74min、4.42min和5.42min，各峰之间无交叉重叠，空白组织样本在上述时间点均无明显干扰峰出现。结果表明此方法具有较高的专属性，适合达立通颗粒中各成分的含量测定。

3.1.2 线性关系考察

线性关系考察结果表明，在胃肠组织中，11个黄酮类化合物的相关系数（R平方）在0.9900～0.9998，7个非黄酮类化合物的R平方均在0.9909～0.9994，线性关系良好，符合要求。

3.1.3 精密度与提取回收率

低、中、高质控样品精密度考察结果均符合RSD%＜15%要求。11个黄酮类化合物批内精密度偏差为1.74%～12.89%，批间精密度偏差为2.30%～12.29%。7个非黄酮类化合物日内精密度偏差为2.16%～13.52%，批间精密度偏差为2.72%～12.10%。以上结果表明本实验所用设备和方法精密度良好，满足要求。另外黄酮类待测化合物的提取回收率均在91.76±7.63%～111.10±7.10%之间，非黄酮类待测化合物的提取回收率均在93.08±7.02%～112.09±9.71%之间，均符合80%～120%要求。

3.1.4 稳定性考察

含药胃肠组织样本处理好置于室温8h后检测，所有待测化合物的偏差为2.09%～14.54%，例如川陈皮素偏差为4.21%～11.78%，桔皮素偏差为3.04%～4.51%；置于自动进样器中24h后检测，所有待测化合物的偏差为1.73%～14.71%，例如柚皮素偏差为3.29%～13.00%，橙皮素偏差为4.07%～10.97%；-80℃冰箱和室温反复冻融3次后检测，所有待测化合物的偏差为1.83%～14.80%，例如原阿片碱偏差为2.32%～7.11%，黄连碱偏差为5.25%-5.26%；冻存2周后检测，所有待测化合物的偏差为1.47%～14.57%，例如小檗碱偏差为1.74%-4.14%，甜橙黄酮偏差为3.37%～9.23%；各18个待测化合物含量均符合RSD%＜15%，表明在上述条件下样品基本稳定。

3.1.5 基质效应

本实验评价了6只大鼠空白胃肠中低中高浓度水平的基质效应，单个来源基质的基质效应为90.29±5.73%～108.28±3.47%，均符合要求，表明各待测化合物的含量测定不受基质的影响。

3.2  动物模型验证

3.2.1 动物体重监测

实验开始时各大鼠体重无明显差异。在模型组经夹尾刺激结合不规律饮食造模7天后，空白组大鼠平均体重近248±5.55g，模型组平均体重近211±5.81g，相较于空白对照组，具有显著性差异（P<0.01）。继续造模至第14天，空白组大鼠平均体重近316±8.34g，模型组平均体重约为263±4.11g（P<0.01）。表明本实验采用的造模方法造模后，大鼠体重降低。

3.2.2 胃肠运动考察

胃排空和小肠推进结果显示，空白组大鼠平均胃排空率约为63.22±6.37%，平均小肠推进率约为72.18±1.32%。而模型组大鼠平均胃排空率约为27.17±5.70%，平均小肠推进率约为58.26±2.30%，胃肠运动指标均显著低于空白组（P<0.01）。表明本实验采用的造模方法造模后，大鼠胃肠运动减慢，胃肠功能障碍。

3.2.3 胃肠病理学考察

胃部组织病理学检查结果显示，模型组大鼠的胃部H&E染色与空白组大致相同，胃黏膜上皮结构完整，细胞无坏死且排列紧密，固有层腺体、黏膜下层和肌层未见坏死。另十二指肠透射电镜结果显示，空白组十二指肠微绒毛排列紧密，细胞间紧密连接结构清晰。而模型组十二指肠肠粘膜存在较多紧密连接不完全且连续性遭到破坏。表明本实验采用的造模方法未出现胃肠组织的器质性病变，符合FD的病理特征。由上述结果可知，本实验建立的FD模型成功，可继续进行后续达立通颗粒中主要活性成分在空白组和FD模型组大鼠胃肠道中的分布及差异研究。

3.3 组织分布差异研究

结合文献报道及本实验室前期对达立通颗粒体内成分分析的结果，选择含量较高、易得、可测的18个成分进行在胃肠道中的组织分布及空白组和FD模型组大鼠分布差异研究，包括：牡荆素-4''-O-葡糖苷、原阿片碱、黄连碱、小檗碱、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、去甲基川陈皮素、木香烃内酯、去氢木香内酯、原儿茶酸、伞形花内酯、木犀草苷、橙皮苷、木犀草素、柚皮素、橙皮素和白杨素。

3.3.1 黄酮类化合物分布差异研究

研究结果显示大鼠给药达立通颗粒后，主要黄酮类活性成分在空白组和FD模型组大鼠体内各胃肠组织中1h，3h和6h的浓度。结果表明，11个黄酮类成分在空白组和FD模型组中含量差异显著，且在各组织中达到最高浓度的时间点差异较大。在空白大鼠胃、十二指肠和空肠组织中，各待测化合物基本在1h快速达到最高浓度。但在模型组中，化合物浓度较空白组基本降低，例如柚皮素、川陈皮素和橙皮素等。随着药物不断从胃、十二指肠、空肠、回肠到结肠推进，在回肠和结肠部位，开始渐渐出现了达峰时间延后的现象，有的甚至在6h浓度最高，例如去甲基川陈皮素、甜橙黄酮和白杨素等黄酮类化合物。另外，各化合物在空白模型不同组织中的分布差异较大。黄酮类化合物苷元如川陈皮素在组织中的分布情况迅速且稳定，在给药后1h内就已经广泛分布于各组织中，随着胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收代谢推进，且随着时间的推移其浓度逐渐降低，空白组、模型组含量具有一定差异。黄酮苷如橙皮苷能在胃肠组织中各时间点检出，在各组织中含量居高且达峰迅速。其中在空肠中浓度最高，其次是胃和其他肠组织，但在回肠中基本没有分布。

3.3.2 其他类化合物分布差异研究

研究结果显示大鼠给药达立通颗粒后，主要非黄酮类活性成分在正常组和FD模型组大鼠体内各胃肠组织中1h，3h和6h的浓度。结果表明，7个非黄酮类成分在正常组和FD模型组中浓度明显较显著，且在各组织中达到最高浓度的时间点差异也较大。正常大鼠胃和十二指肠组织中，各待测化合物基本在1h时，暴露水平最高。但在模型组中，上述化合物在各组织中浓度较空白组有所下降，部分具有显著差异，例如：胃组织中的黄连碱（P<0.01）、原阿片碱（P<0.0001）和伞形花内酯（P<0.01）。在模型组大鼠中，伞形花内酯在胃组织中3h时浓度最高，随着药物不断从胃、十二指肠、空肠、回肠到结肠推进，在回肠和结肠部位，部分药物甚至在6h时浓度才最高，例如黄连碱、小檗碱、原阿片碱和伞形花内酯等非黄酮类化合物。在结肠部位，部分生物碱如小檗碱和黄连碱，出现模型组浓度显著高于空白组的情况（P<0.0001），推测可能是由于造模后大鼠胃肠动力不足，蠕动缓慢，导致药物到达结肠部位延后及代谢减缓。

另外，值得注意的是，橙皮苷、橙皮素、柚皮素、原儿茶酸、去氢木香内酯、川陈皮素、去甲基川陈皮素、小檗碱和桔皮素在胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠中暴露水平较高，且在空白和模型组中各时间点下的浓度差异较显著，提示这些成分的体内分布受到胃肠道蠕动的影响。

4 讨论

中药复方或中成药因所含化学成分复杂、理化性质不一、有效成分含量差异大等原因，导致在研究其有效成分体内暴露水平存在困难。近年来，随着极高灵敏度和宽动态线性范围质谱仪的普及，使得较为全面描述中药复方或中成药中活性成分的体内暴露情况成为可能。本研究应用UPLC-QTRAP-MS/MS技术结合动物实验，采用MRM扫描模式，分别以氟西汀和双氯芬酸为正、负离子模式下的内标化合物，UPLC-QTRAP-MS/MS法测定了大鼠胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠组织中达立通颗粒中主要活性成分在空白组和FD模型组的浓度。在此基础上，研究了各化合物随时间点和不同胃肠组织的分布差异。从不同胃肠组织含量方面分析，达立通颗粒主要活性成分在胃及不同肠段中含量差异较大。对比不同组织中主要活性成分的的含量发现，黄酮类化合物的占比较大，其次为萜类和生物碱类化合物。从不同组别含量分析，本实验结果表明，正常组基本在1h可达最高浓度。与空白组相比，FD模型组中各待测化合物的含量普遍降低。在十二指肠组织各化合物代谢趋势基本与胃部组织一致。随着药物不断从胃到肠的推进代谢，各被测化合物的达峰时间逐渐延后。最终，在6h的结肠部位靶向监测到部分生物碱如小檗碱、原阿片碱和黄连碱等，出现模型组含量显著高于空白组的情况。另外，以各化合物在各组织的含量为基准筛选在各脏器中有较高分布，且在空白组和模型组各时间点含量差异较大的化合物。以下化合物可作为达立通颗粒给药后在胃肠部位的高暴露化学成分，包括：橙皮苷、橙皮素、柚皮素、原儿茶酸、去氢木香内酯、川陈皮素、去甲基川陈皮素、小檗碱和桔皮素，推测可能是影响FD胃肠动力障碍的主要成分。达立通颗粒中18个主要活性成分的定量方法开发验证、组织分布研究及不同模型分布差异对比，对达立通颗粒体内代谢和药效物质基础研究具有一定的参考价值。

 

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